Kvantifiering av Svamp kolonisering, sporogenes och produktion av mykotoxiner användningen av kernel Bioanalyser
Summary
Förödelsen av spannmål för utsäde-infekterar svampen har fått många forskningsinsatser för att bättre förstå växt-patogen interaktioner. Att studera frö-svamp interaktioner i en laboratoriemiljö, har vi utvecklat en robust metod för kvantifiering av svamp reproduktion, biomassa och kontaminering med mykotoxiner användningen av kernel bioanalyser.
Abstract
Den ruttnande av korn med utsäde infekterar svampar utgör en av de största ekonomiska utmaningarna för global spannmålsproduktion, för att inte tala om allvarliga risker för människors och djurs hälsa. Bland spannmålsproduktion, är majs utan tvekan den mest drabbade grödan på grund av patogen-inducerade förluster i spannmål integritet och mykotoxiner frön förorening. De två vanligaste och problematiska mykotoxiner för majs odlare och mat och processorer foder är aflatoxin och fumonisin, som framställts av Aspergillus flavus och Fusarium verticillioides, respektive.
Nyligen genomförda studier inom molekylär växt-patogen interaktioner har visat lovande resultat i att förstå specifika mekanismer som är förknippade med växter svar svampinfektion och kontaminering med mykotoxiner 1,2,3,4,5,6. Eftersom många laboratorier använder kärnan analyser för att studera växt-patogen interaktioner, finns det ett behov av en standardiserad metod för kvantifiering av olika biologiska parametrar, såresultat från olika laboratorier kan cross-tolkas. För en robust och reproducerbart sätt för kvantitativa analyser av frön, har vi utvecklat i-lab kärnan analyser och efterföljande metoder för att kvantifiera svamptillväxt, biomassa och kontaminering med mykotoxiner. Fyra steriliserade majs kärnor ympas i glasampuller med en svampsuspension (10 6) och inkuberades under en förutbestämd period. Provflaskor selekteras sedan för räkning av konidier med hemocytometer, ergosterol-baserad biomassa analys genom high performance vätskekromatografi (HPLC), aflatoxin kvantifiering med användning av en fluorometer AflaTest metod, och fumonisin kvantifiering genom HPLC.
Protocol
Discussion
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi vill tacka Brandon Hassett och Carlos Ortiz för deras tekniskt bistånd. Detta arbete stöddes av NSF bidrag IOB-0544428, IOS-0951272 och IOS-0925561 till Dr Michael Kolomiets, och av USDA National Institute of Food och jordbruksorganisation (NifA), Afri Växtförädling och utbildning Grant # 2010-85.117 -20.539 till Dr. Seth Murray, Thomas Isakeit och Michael Kolomiets.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalog # |
| Potato Dextrose Agar | Fisher Scientifc | S71659A |
| Tween-20 | Fisher Scientifc | BP337-100 |
| Plastic incubation container | Sterilite | 1713LAB06 |
| Blender | Vicam | 20200 |
| 24 cm Fluted Filter Papers | Vicam | 31240 |
| 1.5 μm glass microfibre | Vicam | 31955 |
| Afla Test column | Vicam | G1024 |
| Afrla Test Developer | Vicam | 32010 |
| Methanol | Vicam | 35016 |
| Acetonitrile | Fisher Scientifc | AC14952-0025 |
| Ethanol | Fisher Scientifc | AC39769-0025 |
| C-18 solid phase extraction column (Prep SEP SPE C18 Column) | Fisher Scientifc | 60108-304 |
| O-phthalaldehyde (OPA) | Sigma Chemical Co | 79760-5g |
| Boric acid | Fisher Scientifc | BP168-500 |
| Sodium borate | Fisher Scientifc | RDCS0330500 |
| Mercaptoethanol | Fisher Scientifc | 45-000-231 |
| Shimadzu HPLC LC-20AT (Pump) | Shimadzu Scientific Instruments, Inc. | LC-20AT |
| Zorbax ODS column (4.6x150mm) | Agilent Technologies | 443905-902 |
| Shimatzu RF-10Axl fluorescence detector | Shimadzu Scientific Instruments, Inc. | RF-10AXL |
| Sodium phosphate | Fisher Scientifc | AC38987-0010 |
| FB1 standards | Sigma Chemical Co. | F1147-1mg |
| Chloroform | VWR | MK444410 |
| 13 mm syringe filter with 0.45 um nylon membrane (HPLC) | Pall Life Science | 4426 |
| Ergosterol | Sigma-Aldrich | 45480-50G-F |
| Scintillation vials | VWR | 66021-602 |
| Sodium Chloride | Vicam | G1124 |
Referências
- Tsitsigiannis, D. I., Keller, N. P. Oxylipins as developmental and host-fungal communication signals. Trends Microbiol. 15, 109-118 (2007).
- Gao, X., Shim, W. -. B., Göbel, C., Kunze, S., Feussner, I., Meeley, R., Balint-Kurti, P., Kolomiets, M. Disruption of a maize 9-lipoxygenase results in increased resistance to fungal pathogens and reduced levels of contamination with mycotoxin fumonisin. Mol. Plant-Microbe Interact. 20, 922-933 (2007).
- Brodhagen, M., Tsitsigiannis, D. I., Hornung, E., Goebel, C., Feussner, I., Keller, N. P. Reciprocal oxylipin-mediated cross-talk in the Aspergillus – seed pathosystem. Mol. Microbiol. 67, 378-391 (2008).
- Gao, X., Brodhagen, M., Isakeit, T., Brown, S. H., Göbel, C., Betran, J., Feussner, I., Keller, N. P., Kolomiets, M. V. Inactivation of the lipoxygenase ZmLOX3 increases susceptibility of maize to Aspergillus spp. Mol. Plant-Microbe Interact. 22, 222-231 (2009).
- Gao, X. Q., Kolomiets, M. V. Host-derived lipids and oxylipins are crucial signals in modulating mycotoxin production by fungi. Toxin Rev. 28, 79-88 (2009).
- Mukherjee, M., Kim, J. -. E., Park, Y. -. S., Kolomiets, M. V., Shim, W. -. B. Regulators of G protein signaling in F. verticillioides mediate differential host-pathogen responses on non-viable versus viable maize kernels. Mol. Plant Pathol. 12, 479-491 (2011).
- Zheng, M. Z., Richard, J. L., Binder, J. A review of rapid methods for the analysis of mycotoxins. Mycopathologia. 161, 261-273 (2006).
- Bacon, C. W., Bennett, R. M., Hinton, D. M., Voss, K. A. Scanning electron microscopy of Fusarium moniliforme within asymptomatic maize kernels and kernels associated with equine leukoencephalomalacia. Plant Dis. 76, 144-148 (1992).
- Munkvold, G. P., Hellmich, R. L., Rice, L. G. Comparison of fumonisin concentrations in kernels of transgenic Bt maize hybrids and nontransgenic hybrids. Plant Dis. 83, 130-138 (1999).
- Sagaram, U. S., Shaw, B. D., Shim, W. -. B. Fusarium verticillioides GAP!, a gene encoding a putative glycolipid-anchored surface protein, participates in conidiation and cell wall structure but not virulence. Microbiol. 153, 2850-2861 (2007).
- Shim, W. -. B., Flaherty, J. E., Woloshuk, C. P. Comparison of Fumonisin B1 biosynthesis in maize germ and degermed kernels by Fusarium verticillioides. J. Food Protect. 66, 2116-2122 (2003).
- Shim, W. -. B., Woloshuk, C. P. Regulation of fumonisin B1 biosynthesis and conidiation in Fusarium verticillioides by a cyclin-like (C-type) gene, FCC1. Appl. Environ. Micrbiol. 67, 1607-1612 (2001).
- Christensen, S. A. . Conversation with: Won-Bo Shim. , (2011).
- Shin, J. -. H., Shim, W. -. B. Characterization of PPR1 and PPR2, genes encoding regulatory subunits of protein phosphatase 2A in Fusarium verticillioides. Phytopathol. 99, S119 (2009).
- Breivik, O. N., Owades, J. L. Spectrophotometric Semimicrodetermination of Ergosterol in Yeast. Yeast. Agric. and Food Chem. 5, 360-363 (1957).
