İnsan Mantar şeklinde Lezzet papilla hücrelerinin izolasyonu ve Kültürü
Summary
Biz insan mantarbiçim tat papilla hücrelerinin uzun süreli kültürlerde izole edilmesi ve sürdürülmesi için tekrarlanabilir bir protokol geliştirmeyi amaçladık. Biyopsi ile elde edilen insan mantarbiçim papilla hücreleri başarıyla canlılık kaybı olmadan daha sekiz pasajlar (12 ay) için kültüre edildi.
Abstract
Tat hücreleri gıdaların içerdiği basit uyaranlara ve karmaşık kimyasal moleküllerin geniş bir algılama izin özgü histolojik, moleküler ve fizyolojik özelliklere sahip, son derece uzmanlaşmış bulunmaktadır. İnsan, bireysel mantarbiçim papillada sıfırdan 20 kadar tat tomurcukları ihtiva etmektedir. Birden çok hücre döngüsü için kültür tat papilla hücrelerini korumak için yeteneği bu eşsiz duyusal hücrelerin, moleküler rejeneratif ve fonksiyonel özellikleri tanımlamak için önemli faydası olacaktır ancak kültür, insan tat hücreleri için oluşturulmuş protokol vardır. Tat hücrelerinin daha önceki çalışmalarda primer kültür, kemirgenler gelen eksplant kültürleri, ya da doku dilimleri 1,2,3,4 yarı sağlam tat tomurcukları taze olarak izole edilen hücreler kullanılarak yapılmıştır. Bu preparatlar, her avantajlara sahip olmakla birlikte, uzun dönem kültürlerin gelişimi, özellikle tat hücre proliferasyonu ve yönün çalışmaları için, önemli avantajlar sağladığı olacaktırentiation. Bizimki de dahil olmak üzere çeşitli gruplar, tat hücre kültürü modellerin geliştirilmesi ve kurulması ilgi olmuştur. Kültür tat hücreleri girişimleri, 3-5 d 5,6,7,8 ötesinde genellikle kalıcı değildir hücreleri ile sınırlı canlılığı bildirdin. Biz son zamanlarda kemirgen tat hücrelerinin 9 genişletilmiş kültürü için başarılı bir yöntem bildirdi. Biz burada ilk kez izole insan mantarbiçim tadı papilla hücrelerinin in vitro kültür sistemi bir kurulması için rapor. Biyopsi ile elde edilen insan mantarbiçim papilla hücreleri başarıyla canlılık kaybı olmadan daha sekiz pasajlar (12 ay) için kültüre edildi. Hücreler olgun tat hücrelerinin karakteristik birçok moleküler ve fizyolojik özellikleri görüntülenir. Gustducin ve fosfolipaz C β2, (PLC-β2) mRNA ters transkriptaz-polimeraz zincir reaksiyonu ile birçok hücre tespit ve sıralama tarafından teyit edildi. İmmünositokimya analizi bora varlığını göstermiştirKültüre tat hücrelerinde ducin ve PLC-β2 ifade. Kültürlü insan mantarbiçim hücreleri de tat reseptörleri ve sinyal yolunun en azından bazı mevcut olduğunu gösteren birçok tat uyaran Uygun konsantrasyonlarda yanıt olarak hücre içi kalsiyum artış sergiledi. Bu sonuçlar yeterli yetişkin insanlardan tat hücreleri oluşturulur ve en az sekiz geçişleri için muhafaza edilebilir olduğunu göstermektedir. Hücrelerin çoğu bir model tat sistemi olarak kullanımı desteklemek için yetişkin tadı epitelden akut izole hücrelerin fizyolojik ve biyokimyasal özelliklerini korurlar. Bu sistem, in vitro hazırlanmasında bir memeli tat reseptör hücrelerin proliferasyonu, farklılaşması ve işlevi ile ilgili işlemlerin çalışmalara sağlayacaktır.
Insan mantarbiçim hücre kültürü oluşturulması için kullanılan İnsan mantarbiçim tadı papilla incelendi araştırma protokolleri altında uygun bilgilendirilmiş onam sonrasında araştırma için hibe edildive İDD komitesi tarafından onaylandı. Protokolü (# 0934) Schulman Associates Kurumsal Değerlendirme Kurulu Inc, Cincinnati, OH tarafından onaylandı. Aşağıda yazılı bir protokol Özdener ark yayınlanan parametreleri dayanmaktadır. 2011 10.
Protocol
Discussion
Biz 12 aylık bir dönemi kapsayan, 8 üzerinden geçişler için insan mantarbiçim tat papilla elde edilen hücrelerin korumuştur. Bu kültürler bunlar tat reseptör hücrelerinin anahtar moleküler ve fizyolojik özelliklerine ilave olarak, olgun tat hücre tipleri birkaç belirteçler ifade burada aşama için in vitro olgunlaşması birçoğu yeni hücreler, üretir. Varlığı gustducin-ve PLC-β2 kültürlü hücrelerin alt gruplarında immünoreaktivite bu sonuç ile tutarlıdır. En önemlisi, bazı …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biz Aimee Myers ve teknik beceri ve yardım için Esi Quayson teşekkür ederim. Bu çalışma NSF 0216310 ve GIVAUDAN Inc hibe (NER) tarafından kısmen desteklenmiştir.
Materials
| Name of the reagent | Company |
| MCDB 123 | Sigma-Aldrich |
| Iscove’s DMEM Medium | MediaTech |
| Elastase | Sigma-Aldrich |
| Pronase E | Sigma-Aldrich |
| Elastase | Worthington |
| Soy bean trypsin inhibitor | Worthington |
| Collagenase type 1 | Worthington |
| Rat tail collagen type 1 | BD Sciences |
| Fura-2 AM | Molecular Probes |
| Superscript First Strand Synthesis System for RT-PCR | Invitrogen |
| Leica TCS SP2 Spectral Confocal Microscope | Leica Microsystems Inc. |
| Discovery-1 imaging station and Metamorph software | Molecular Devices |
| Small fine-tip forceps and extra fine spring scissors | Fine Science Tools |
Referências
- Mbiene, J. P., Maccallum, D. K., Mistretta, C. M. Organ cultures of embryonic rat tongue support tongue and gustatory papilla morphogenesis in vitro without intact sensory ganglia. J. Comp. Neurol. 377, 324-340 (1997).
- Miyamoto, T., Fujiyama, R., Okada, Y., Sato, T. Strain difference in amiloride-sensitivity of salt-induced responses in mouse non-dissociated taste cells. Neurosci. Lett. 277, 13-16 (1999).
- Caicedo, A., Jafri, M. S., Roper, S. D. In situ Ca2+ imaging reveals neurotransmitter receptors for glutamate in taste receptor cells. J. Neurosci. 20, 7978-7985 (2000).
- Qin, Y. M., Shi, J. Q., Zhang, G. H., Deng, S. P., Wang, T. H. A reliable method to obtain cells of taste buds from fungiform papillae of mice. Acta Histochem. 112, 107-112 (2010).
- Spielman, A. I., Mody, I., Brand, J. G., Whitney, G., MacDonald, J. F., Salter, M. W. A method for isolating and patch-clamping single mammalian taste receptor cells. Brain Res. 503, 326-329 (1989).
- Kishi, M., Emori, Y., Tsukamoto, Y., Abe, K. Primary culture of rat taste bud cells that retain molecular markers for taste buds and permit functional expression of foreign genes. Neurociência. 106, 217-225 (2001).
- Ruiz, C. J., Stone, L. M., McPheeters, M., Ogura, T., Bottger, B., Lasher, R. S., Finger, T. E., Kinnamon, S. C. Maintenance of rat taste buds in primary culture. Chem. Senses. 26, 861-873 (2001).
- Stone, L. M., Tan, S. S., Tam, P. P., Finger, T. E. Analysis of cell lineage relationships in taste buds. J. Neurosci. 22, 4522-4529 (2002).
- Ozdener, H., Yee, K. K., Cao, J., Brand, J. G., Teeter, J. H., Rawson, N. E. Characterization and long-term maintenance of rat taste cells in culture. Chem. Senses. 31, 279-290 (2006).
- Ozdener, M. H., Brand, J. G., Spielman, A. I., Lischka, F. W., Teeter, J. H., Breslin, P. A., Rawson, N. E. Characterization of Human Fungiform Papillae Cells in Culture. Chem. Senses. 36, 601-612 (2011).
- Gomez, G., Rawson, N. E., Hahn, C. G., Michaels, R., Restrepo, D. Characteristics of odorant elicited calcium changes in cultured human olfactory neurons. J. Neurosci. Res. 62, 737-749 (2000).
- Wolozin, B., Sunderland, T., Zheng, B. B., Resau, J., Dufy, B., Barker, J., Swerdlow, R., Coon, H. Continuous culture of neuronal cells from adult human olfactory epithelium. J. Mol. Neurosci. 3, 137-146 (1992).
- Wick, N., Saharinen, P., Saharinen, J., Gurnhofer, E., Steiner, C. W., Raab, I., Stokic, D., Giovanoli, P., Buchsbaum, S., Burchard, A., Thurner, S., Alitalo, K., Kerjaschki, D. Transcriptomal comparison of human dermal lymphatic endothelial cells ex vivo and in vitro. Physiol. Genomics. 17, 179-192 (2007).
- Fu, L., Zhu, L., Huang, Y., Lee, T. D., Forman, S. J., Shih, C. C. Derivation of neural stem cells from mesenchymal stemcells: evidence for a bipotential stem cell population. Stem Cells Dev. 17, 1109-1121 (2008).
- Sandow, S. L., Grayson, T. H. Limits of isolation and culture: intact vascular endothelium and BKCa. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 297, H1-H7 (2009).
