初代ヒトナイーブおよびメモリーT細胞から誘導した調節性T細胞の生成
Summary
我々は、単一のヒトの血液ドナーからの規制は、メモリとナイーブT細胞を生成する方法を説明します。偏Tregsのは、その後もここで詳述抑制アッセイを含む遺伝的均一性を持つ遺伝子や機能のさまざまなアプリケーション内の他のサブセットと比較することができます。
Abstract
免疫CD4 +制御性T細胞（Tregの）の開発と保守はで、人体の自己と共生抗原の膨大な量の免疫学的恒常性のままにするために必要な末梢性寛容に貢献しています。 Tregsのと炎症、従来のT細胞のバランスの乱れは、免疫病理や癌になる可能性があります。 Tregの治療注入大腸炎1、I型糖尿病2、関節リウマチ、移植片対宿主病は、ヒト対マウスTregの生物学5の4いくつかの根本的な違いのマウスモデルに有効であることが示されているが、これまでの臨床使用を排除しています。十分な数、純度、安定性と治療Tregのホーミング特異性の欠如は、彼らのex vivoでの拡張6のための条件を最適化する上で人間のTregの開発のダイナミックなプラットフォームを必要とした。
ここでは、Din vitroでの細胞培養と蛍光活性化末梢血単核細胞、CD4の磁気選択+ T細胞の分離、4つの段階に分けることができ、単一のヒト末梢血ドナーから誘導Tregsの（iTregs）の分化方法を傍接させるT細胞サブセットの細胞選別（FACS）。 Tregの署名の転写因子のフォークヘッドボックスのP3（Foxp3は）人間の7の活性化誘導転写因子および他のユニークなマーカーであるため存在しますが、マーカーの組み合わせパネルは抑制活性を有するT細胞を同定するために使用する必要があります。文化の中で6日後、私たちのシステムの細胞がナイーブT細胞は、CD25とCD45RAのそれらの相対的発現に基づいてメモリーT細胞またはiTregsに画定することができます。メモリなどとナイーブT細胞はCD45RA +およびCD45RO +サブセットができますbに初期のT細胞集団の事前選別は、別の報告偏光の要件と塑性挙動8を持っているeは、これらの不一致を調べるために使用されます。他者との一貫性のある、私たちのCD25 こんにちは CD45RA – FoxP3の9のiTregs急行高レベル、GITRおよびCTLA-4 11およびCD127 12の低レベル。各集団のFACSに続いて、得られた細胞は、カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（CFSE）で標識したT細胞自家の増殖を抑制するための相対的能力を評価し、抑制アッセイで使用することができます。
Protocol
1。バフィーコートからヒト末梢血単核細胞（PBMC）の分離病院や近くの血液センターの場所からバフィーコートのいずれかの単位を取得します。私たちの血液センターでは、正常な血液ドナーから得た単位当たりのバフィコートの約40〜60 mLで提供してくれます。 バフィーコートを希釈するために滅菌したPBSを含むオートクレーブ500mLのガラス瓶に血液を注ぐ。 PBS +バフィーコ?…
Discussion
Tregの転送が自己免疫移植片拒絶反応および他の免疫または炎症媒介性疾患との闘いで膨大な治療可能性を秘めていますが、その効率的な生成と安定した保守のための方法はまだ開発されていない。ヒトT細胞を循環させる唯一の百分の1から5は、Tregsのであるので、その制御の拡大と分化は、クリニックにTregの実装の主要な抑止力としては、この不足を克服しています。我々はTGN1412試験13…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
<p class="jove_content">著者は、フローサイトメトリー解析とソーティングと彼らの支援についてジェニファー·ストレンジとグレッグ·バウマンに感謝したいと思います。この作品は、NCRRからNIHグラント番号2P20 RR020171によってサポートされており、FMにケンタッキー大学のスタートアップ資金によりされた。GIEは、大統領大学院フェローシップとケンタッキー州の機会奨学金の支援を承認します。</p>
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue Number | Comments |
| Lymphoprep | Axis-Shield | 1114547 | Keep at room temperature |
| Refrigerated Bench-Top Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Bright-Line Hemocytometer | Hausser Scientific | 3110 | |
| EasySep Human CD4+ T Cell Enrichment Kit | Stem Cell Technologies | 19052 | |
| EasySep Human Memory CD4+ T Cell Enrichment Kit | Stem Cell Technologies | 19157 | |
| EasySep Human Naïve CD4+ T Cell Enrichment Kit | Stem Cell Technologies | 19155 | |
| The Big Easy EasySep Magnet | Stem Cell Technologies | 18001 | Silver |
| 5 mL Round Bottom Polystyrene Tubes | BD Falcon | 352008 | |
| 15 mL Polypropylene Centrifuge Tubes | VWR | 89004-368 | |
| 14 mL Polypropylene Round-Bottom Tubes | BD Falcon | 352059 | |
| 50 mL Polypropylene Centrifuge Tubes | VWR | 89004-364 | |
| Human anti-CD3 Antibody | Bio X Cell | BE0001-2 | Clone: OKT3 |
| 24 Well Cell Polystyrene Culture Plate | BD Falcon | 353047 | |
| 96 Well Round Bottom Tissue Culture Plate | Grenier Bio-One | 650180 | |
| RPMI 1640 with Glutamax-I and HEPES Buffer | Gibco | 72400 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 16000 | |
| β-Mercaptoethanol | Sigma | M7522 | |
| Recombinant Human TGF-β1 | eBioscience | 14-8348-62 | |
| Recombinant Human IL-2 | eBioscience | 14-8029-63 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | MP Biomedicals Inc. | 810531 | |
| 0.5 M EDTA | Amresco | E177 | |
| Mouse Anti-Human CD25-PE | Miltenyi Biotec | 130-091-024 | Clone: 4E3 |
| Mouse Anti-Human CD45RA-PE-Cy5 | eBioscience | 15-0458-42 | Clone: HI100 |
| Mouse Anti-Human CD127-APC | Miltenyi Biotec | 130-094-890 | Clone: MB15-18C9 |
| DNase II | MP Biomedicals Inc. | 190370 | |
| MoFlo Flow Cytometer | Beckman Coulter | ||
| FlowJo Software | Tree Star, Inc. | ||
| Cell Quest Pro Software | BD Biosciences | ||
| Newborn Calf Serum | Gibco | 16010 | |
| L-glutamine | Gibco | 25030 | |
| AIM-V | Gibco | 0870112 | |
| CellTrace CFSE Cell Proliferation Kit | Invitrogen | C34554 | |
| Treg Suppression Inspector Beads | Miltenyi Biotec | 130-092-909 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140 | |
| 40 μM Nylon Cell Strainer | BD Falcon | 352340 |
Referências
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Citar este artigo
Ellis, G. I., Reneer, M. C., Vélez-Ortega, A. C., McCool, A., Martí, F. Generation of Induced Regulatory T Cells from Primary Human Naïve and Memory T Cells. J. Vis. Exp. (62), e3738, doi:10.3791/3738 (2012).