Visualização dos vasos coronários é fundamental para avançar na compreensão das doenças cardiovasculares. Descrevemos aqui um método para a perfusão vasculatura coronária murino com uma borracha de silicone radiopaco (Microfil), em preparação para imagiologia Tomografia micro-computadorizada (μCT).
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Artigo de método
Perfusão retrógrada e enchimento da vasculatura coronariana do rato como preparação para Micro tomografia computadorizada
Neste artigo
Resumo
Resumo
Visualização da vasculatura está se tornando cada vez mais importante para compreender muitos estados diferentes da doença. Enquanto existem várias técnicas para geração de imagens vasculatura, poucos são capazes de visualizar a rede vascular como um todo, enquanto se estende a uma resolução que inclui o menor 1,2 navios. Além disso, muitas técnicas de fundição vasculares destruir o tecido circundante, impedindo posterior análise da amostra 3-5. Um método que contorna essas questões é micro-tomografia computadorizada (μCT). μCT imagem pode digitalizar com resoluções menos de 10 mícrons, é capaz de produzir reconstruções 3D da rede vascular, e deixa o tecido intacto para posterior análise (por exemplo, histologia e morfometria) 6-11. Contudo, os navios de imagem por métodos ex vivo μCT exige que os navios ser preenchido com um composto radiopaco. Como tal, a representação precisa da vasculatura produzido por μCT imagem está dependenterecheio fiável e completa dos vasos. Neste protocolo, descrevem uma técnica para encher vasos coronarianos de rato em preparação para a imagem μCT.
Duas técnicas predominam existem para o enchimento da vasculatura coronária: in vivo através de canulação e retrógrada de perfusão da aorta (ou uma ramificação fora do arco aórtico) 12-14, ou ex vivo através de uma perfusão de Langendorff 15-17 sistema. Aqui nós descrevemos um método in vivo canulação aórtica, que foi projetado especificamente para garantir o preenchimento de todos os navios. Usamos um composto radiopaco de baixa viscosidade que pode chamado Microfil perfundir através dos navios mais pequenos para preencher todos os capilares, assim como ambos os lados arteriais e venosas da rede vascular. Os vasos são perfundidos com tampão utilizando um sistema de perfusão pressurizado e, em seguida cheio com Microfil. Para garantir que Microfil enche os pequenos vasos de maior resistência, nós ligadura dos ramos grandes emanating da aorta, que desvia a Microfil nas coronárias. Uma vez que o enchimento é completa, para evitar que a natureza elástica do tecido cardíaco de espremer Microfil fora de alguns vasos, nós ligadura acessíveis principais pontos de saída vasculares imediatamente após o enchimento. Portanto, a nossa técnica é otimizado para o preenchimento completo e máximo de retenção do agente de enchimento, permitindo a visualização da rede vascular coronária completa - artérias, capilares e veias iguais.
Protocolo
1. Os preparativos antes do início
- Encha cada lado do aparelho de perfusão com tampão de pressão vasodilatador (4mg / L Papaverina + 1 g / L adenosina em PBS) ou paraformaldeído a 4% (PFA) em PBS, respectivamente.
- Prepara-se uma seringa de insulina 1/2cc (com um 29G permanentemente ligado ½ "agulha), enchendo-a com 0,1 ml de 1:100 Heparina (estoque 5000U/ml) e dobrando a agulha para ~ ângulo de 120 graus com o bisel para cima. Fazer o mesmo com uma seringa de 1 ml (com uma agulha de 26G ½ ") cheio com 0,3 ml de solução saturada de KCl.
2. A exposição do coração e da canulação da aorta
- Anestesiar o rat....
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Discussão
Tecido cardíaco tem uma procura muito elevada metabólica, e, portanto, requer um fornecimento constante de nutrientes e oxigénio a partir do sangue entregue pela vasculatura coronária. Doenças dos vasos coronários, que diminuem a função coronária devido a estenose do vaso e bloqueio, podem levar à hipóxia tecidual e isquemia, e colocar em risco pacientes acometidos de infarto do miocárdio e um dano irreparável ao músculo do coração. Uma melhor compreensão do estado de doença destes navios é necessário e fundamental para.......
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Divulgações
Os ratos foram tratados com métodos aprovados pelo Institutional Animal Care e do Comitê Utilização da Universidade de Washington e de acordo com o Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório publicado pelo National Institutes of Health EUA (NIH Publication No. 85-23, revista em 1996).
Agradecimentos
Agradecemos ao Dr. Kelly Stevens para os ensaios iniciais do protocolo, o Dr. Michael Simons, Hauch Kip Dr., e os membros de ambos os laboratórios para a discussão geral.
Este trabalho é suportado por NIH concede HL087513 e P01 HL094374.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Nome do reagente | Companhia | Número de catálogo | Comentários |
| Seringas de 1 ml | Becton Dickinson | BD-309602 | |
| 1/2cc seringas de insulina com agulhas fixas ½ 29G " | Becton Dickinson | BD-309306 | |
| 2 "x 2" gaze | Med101store.com | SKU 2208 | |
| 24G ¾ "Angiocath cateter IV | Becton Dickinson | BD-381112 | |
| 26G ½ "bitola agulhas | lank "> Becton Dickinson | BD-305111 | |
| A adenosina | Sigma | A9251 | 1g / L em tampão PBS durante a vasodilatação (com Papaverina) |
| Angled Pinça Graefe | Belas Ferramentas Ciência | 11052-10 | |
| Com ponta de algodão aplicadores: 6 "não-estéril | Cardinal Health | C15055-006 | |
| Curvas tesoura cirúrgica | Belas Ferramentas Ciência | 14085-09 | |
| Dissecando estereoscópio e fonte de luz | Nikon | NA | NA |
| Bandeja de dissecação, 11.5 x 7.5 polegadas | Cole-Parmer | YO-10.915-12 | Cheio de alcatrão para fixando-se o mouse |
| Belas curvas Pinças | Aesculap | FD281R | Precisa de dois |
| Heparina, 5000 estoque U / ml | APP Pharmaceuticals LLC | NDC 63323-047-10 | 1:100 de diluição em água |
| KCl | Pescador | P217 | Solução saturada em H2O |
| A cetamina (Ketaset), 100 ações mg / ml | Fort Dodge, Overland Park, KS, EUA | NDC 0856-2013-01 | Misturados, como peso do corpo 130 mg / kg, com xilazina em 0,9% salinhar |
| Microfil | Fluxo de Tecnologia | MV-122 (amarelo). Outras opções de cores também estão disponíveis. | Misturar 1:1 em peso, com 10% em volume de agente de cura. Prepare-se imediatamente antes da injecção, e vortex para garantir que é bem misturado |
| Não estéril Sutura: 6-0, trançada de seda | Harvard Apparatus | 723287 | |
| Papaverina | Americana Regent Inc. | NDC 0517-4010-01 | 4mg / L em tampão PBS durante a vasodilatação (com adenosina) |
| Paraformaldeído | Sigma | P6148 | Preparado como solução a 4% |
| Aparelho de perfusão | Ver a figura 2 | ||
| Tesoura Primavera | Belas Ferramentas Ciência | 15018-10 | |
| Xilazina (Anased), 20 ações mg / gl | Lloyd Labs | NADA # 139-236 | Misturados, como peso corporal 8,8 mg / kg, com cetamina em solução salina a 0,9% |
Referências
- Couffinhal, T., Dufourcq, P., Barandon, L., Leroux, L., Duplaa, C. Mouse models to study angiogenesis in the context of cardiovascular diseases. Front. Biosci. 14, 3310-3325 (2009).
- Zagorchev, L., Mulligan-Kehoe, M. J. Molecular imaging of vessels in mouse models of disease.
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Reimpressões e permissões
