Nós apresentar um método para formar uma janela de imagem no crânio do rato que se estende por milímetro e é estável durante meses sem inflamação do cérebro. Este método é bem adequado para estudos longitudinais de fluxo de sangue, a dinâmica celular, e as células / estrutura vascular utilizando dois fotões microscopia.
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Artigo de método
A polido e reforçado Janela afinado crânio para longo prazo de imagens do cérebro de camundongo
Neste artigo
Resumo
Resumo
In vivo de imagem da função cortical requer acesso óptico para o cérebro sem interrupção do ambiente intracraniana. Nós apresentamos um método para formar um crânio polido e reforçado diluído (portas) janela no crânio do rato que se estende por vários milímetros de diâmetro e é estável durante meses. O crânio é diluído para 10 a 15 uM de espessura com uma mão de broca para alcançar claridade óptica, e é então revestida com cola de cianoacrilato e uma tampa de vidro para: 1) proporcionar rigidez, 2) inibir crescimento do osso e 3) reduzir a dispersão de luz a partir de irregularidades na superfície do osso. Uma vez que o crânio não seja ultrapassado, qualquer inflamação que pode afetar o processo que está sendo estudado é bastante reduzido. Profundidades de imagem de até 250 uM abaixo da superfície cortical pode ser conseguido usando dois-fotão microscopia laser scanning. Esta janela é bem adequado para estudar o fluxo sanguíneo cerebral e da função celular, tanto em preparações anestesiados e acordado. Além disso, oferece a optunidade para manipular a atividade das células usando optogenetics ou para interromper o fluxo de sangue nos vasos alvo de irradiação de fotossensibilizadores circulando.
Protocolo
1. Preparação para Cirurgia i
- Limpe os instrumentos cirúrgicos por sonicação em uma mistura de leite Maxizyme e cirúrgica em um líquido de limpeza ultra-sônica. Autoclavar os instrumentos cirúrgicos, antes de cada experiência.
- Assegurar que todos os reagentes necessários e descartáveis estão disponíveis. Uma lista de reagentes e produtos descartáveis é fornecido na Tabela 2. Reagentes e produtos descartáveis que entram em contacto com o tecido exposto deve ser estéril, quando possível.
- Induzir a anestesia. Anestésicos típicos adequados para estudos de sobrevivência estão descritos na Tabela 1. Certifique-se de plano cir....
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Discussão
Dois fótons de imagens através de uma janela Portas exige transmissão através do osso diluído e dura-máter, que atenua a luz do laser e adiciona aberrações ópticas em profundidades maiores 8. No entanto, apesar de este inconveniente, a profundidade de imagem até 250 um abaixo da superfície pial pode ser conseguido com 900 nm de excitação. Maiores profundidades de imagem podem, em princípio, seria possível com comprimentos de onda mais longos de excitação 13. Uma grande vantagem deste método é a aus.......
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Divulgações
Nada de divulgar.
Agradecimentos
Este trabalho foi financiado pela American Heart Association (Pós-doutorado bolsa para AYS) e pelo National Institutes of Health (MH085499, EB003832 e OD006831 de DK). Agradecemos a Beth Friedman e Pablo Blinder para comentários sobre o manuscrito.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários | |||
|---|---|---|---|---|---|---|
| Agente | Via de parto | Dose para mouse | Duração | Notas | Fonte | Ref Ref |
| Pentobarbital (Nembutal) | IP | 90 ug / g | 15-60 min | Estreita margem de segurança. Trabalhe até a dose adequada de anestesia lentamente. Suplemento de 10% da dose de indução, conforme necessário. | 036093; Butler Schein | 7 |
| Ketamina (Ketaset) misturado com Xilazina (Anased) | IP | 60 ug / g (K) 10 mg / g (X) (mistura na mesma seringa) | 20-30 min | Xilazina é co-injetado como um relaxante muscular e analgésico. Suplemento apenas Cetamina menos 50% da dose de indução, conforme necessário. | (K) 010,177, (X) 033,198; Butler Schein | 7 |
| Isoflurano (Isothesia) | Inalação | 4% significa a concentração alveolar (MAC) para a indução; 1-2% MAC para manutenção | 4-6 h. | Fornecidas em mistura de oxigénio de 70% e 30% de óxido nitroso. Anestesia prolongada leva a retardar a recuperação. | 029403; Butler Schein | 26 |
Tabela 1. Sugerida agentes anestésicos para estudos de sobrevida.
| ITEM | EMPRESA | catalogo MODELO / |
|---|---|---|
| Betadine | Butler Schein | 6906950 |
| Buprenorfina (Buprenex) | Butler Schein | 031919 |
| Isotiocianato de fluoresceína dextrano, 2 peso molecular MDa | Sigma | FD2000S |
| Álcool isopropílico | Pescador | AC42383-0010 |
| Solução de Ringer com lactato | Butler Schein | 009846; |
| Solução de lidocaína, 2% (v / v) | Butler Schein | 002468 |
| Salina | Butler Schein | 009861 |
| Leite cirúrgico | Butler Schein | 014325 |
| Texas Red dextrano, 70 kDa de peso molecular | Invitrogen | D1864 |
| Maxizyme | Butler Schein | 035646 |
| Descartáveis | ||
| Carbide rebarbas, tamanho do bico 1/2 mm | Belas Ferramentas Ciência | 19007-05 |
| Cottoned aplicadores ponta | Fisher Scientific | 23-400-100 |
| Tampa de vidro, não. 0 espessura | Thomas Scientific | 6661B40 |
| Cola de cianoacrilato | ND Indústrias | 31428 H04308 |
| Espanador de gás | Newegg | N82E16848043429 |
| Pó de cimento aderência | Dentsply | 675571 |
| Punho de cimento solvente | Dentsply | 675572 |
| Seringa de insulina, 0,3 ml de volume com 29,5 agulha de calibre | Butler Schein | 018384 |
| Porcas e parafusos para fixar a cabeça | Digikey | Nut, H723-ND; parafuso, R2-56X1/4-ND |
| Pomada oftálmica | Butler Schein | 039886 |
| Lâminas de bisturi | Fisher Scientific | 12-460-448 |
| Parafusos, self-tapping # 000 | JI Empresa Morris | FF000CE125 |
| Selante de Silicone para aquário | Perfecto Manufacturing | 31001 |
| Pó de óxido de estanho | Minerais Mama | EQT-TINOX |
| EQUIPAMENTO | ||
| Escriba de vidro | Fisher Scientific | 08-675 |
| Microscópio de dissecção | Carl Zeiss | OPMI-1 FC |
| Broca elétrico movido a | Foredom ou Osada | K.1020 (Foredom) ou EXL-M40 (Osada) |
| Navalha elétrica | Wahl | Série 8900 |
| Fórceps, Dumont não. 55 | Belas Ferramentas Ciência | 11255-20 |
| Comentários almofada térmica regulada | FHC | 40-90-8 (termistor rectal, 40-90-5D-02; hcomer pad, 40-90-2-07) |
| Vaporizador de isoflurano | Ohmeda | IsoTec4 |
| Oxímetro de pulso | Starr Ciências da Vida | MouseOx |
| Chave de fenda, em miniatura | Garret Wade | 26B09.01 |
| Estereotáxica | Kopf Instruments | Modelo 900 (com máscara de rato anestesia e não-ruptura barras de ouvido) |
| Tesoura cirúrgica, ponta romba | Belas Ferramentas Ciência | 14078-10 |
| Limpador ultra-sônico | Fisher Scientific | 15-335-30 |
Tabela 2. Lista de reagentes específicos, descartáveis e equipamentos.
Referências
- Cetin, A. Stereotaxic gene delivery in the rodent brain. Nature Protocols. 1, 3166-3173 (2006).
- Kleinfeld, D., Delaney, K. R. Distributed representation of vibrissa movement in the upper layers of somatosensory cortex re....
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Reimpressões e permissões
