En polerad och förstärkt Gallrad-skalle Fönster för långsiktig Imaging för mus Brain
Summary
Vi presenterar en metod för att bilda en avbildning fönster i mus skalle som sträcker sig över millimeter och är stabil under månader utan inflammation av hjärnan. Denna metod lämpar sig väl för longitudinella studier av blodflödet, cellulära dynamik, och cell / vaskulär struktur genom att använda två-foton-mikroskopi.
Abstract
Avbildning in vivo av kortikalt funktion kräver optisk tillgång till hjärnan utan störning av den intrakraniala miljön. Vi presenterar en metod för att bilda en polerad och förstärkt förtunnad skallen (portar) fönster i musen skallen som spänner över flera millimeter i diameter och är stabil i månader. Skallen förtunnas till 10 till 15 pm i tjocklek med en handburen borrmaskin för att uppnå optisk klarhet, och därefter täcktes med cyanoakrylatlim och ett täckglas för att: 1) ger styvhet, 2) inhibera benåterväxt och 3) reducera ljusspridning av oegentligheter på benet ytan. Eftersom skallen inte överskrids, är någon inflammation som kan påverka processen som studeras kraftigt. Bildgivande djup på upp till 250 pm under den kortikala ytan kan åstadkommas med användning av två-foton-mikroskopi laserskanning. Detta fönster är väl lämpad för att studera cerebralt blodflöde och cellulär funktion i både sövda och vakna beredningar. Det erbjuder ytterligare ophet att manipulera cellaktivitet med användning optogenetics eller att störa blodflödet i målinriktade kärl genom bestrålning av cirkulerande fotosensibilisatorer.
Protocol
Discussion
Två-foton-avbildning genom en PORTS fönster kräver transmission genom den förtunnade benet och dura, som dämpar det laserljus och adderar optiska aberrationer på större djup 8. Trots denna nackdel, kan avbildning djup upp till 250 pm under pial ytan uppnås med 900 nm excitering. Större imaging djup kan i princip vara möjligt med längre exciteringsvåglängder 13. En stor fördel med denna metod är avsaknaden av kortikala inflammation som kan finnas övergående i metoder innebär full k…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av American Heart Association (Post-doc stipendium för att ays) och National Institutes of Health (MH085499, EB003832 och OD006831 till DK). Vi tackar Beth Friedman och Pablo Blinder för kommentarer på manuskriptet.
Materials
| Agent | Route of delivery | Dose for mouse | Duration | Notes | Source | Ref Ref |
| Pentobarbital (Nembutal) | IP | 90 μg/g | 15-60 min | Narrow safety margin. Work up to proper dose of anesthesia slowly. Supplement 10 % of induction dose as required. | 036093; Butler Schein | 7 |
| Ketamine (Ketaset) mixed with Xylazine (Anased) | IP | 60 μg/g (K)
10 μg/g (X) (mix in same syringe) |
20-30 min | Xylazine is co-injected as a muscle relaxant and analgesic. Supplement only Ketamine at 50% of induction dose as required. | (K) 010177, (X) 033198; Butler Schein | 7 |
| Isoflurane (Isothesia) | Inhalation | 4% mean alveolar concentration (MAC) for induction; 1-2% MAC for maintenance | 4-6 h. | Provided in mixture of 70% oxygen and 30% nitrous oxide. Prolonged anesthesia leads to slow recovery. | 029403; Butler Schein | 26 |
Table 1. Suggested anesthetic agents for survival studies.
| ITEM | COMPANY | CATALOG # / MODEL |
| Betadine | Butler Schein | 6906950 |
| Buprenorphine (Buprenex) | Butler Schein | 031919 |
| Fluorescein isothiocyanate dextran, 2 MDa molecular weight | Sigma | FD2000S |
| Isopropyl alcohol | Fisher | AC42383-0010 |
| Lactated Ringer’s Solution | Butler Schein | 009846; |
| Lidocaine solution, 2 % (v/v) | Butler Schein | 002468 |
| Saline | Butler Schein | 009861 |
| Surgical Milk | Butler Schein | 014325 |
| Texas Red dextran, 70 kDa molecular weight | Invitrogen | D1864 |
| Maxizyme | Butler Schein | 035646 |
| DISPOSABLES | ||
| Carbide burrs, 1/2 mm tip size | Fine Science Tools | 19007-05 |
| Cottoned tip applicators | Fisher Scientific | 23-400-100 |
| Cover Glass, no. 0 thickness | Thomas Scientific | 6661B40 |
| Cyanoacrylate glue | ND Industries | 31428 H04308 |
| Gas duster | Newegg | N82E16848043429 |
| Grip cement powder | Dentsply | 675571 |
| Grip cement solvent | Dentsply | 675572 |
| Insulin syringe, 0.3 mL volume with 29.5 gauge needle | Butler Schein | 018384 |
| Nut and bolt to secure the head | Digikey | Nut, H723-ND; bolt, R2-56X1/4-ND |
| Opthalmic ointment | Butler Schein | 039886 |
| Scalpel blades | Fisher Scientific | 12-460-448 |
| Screws, self-tapping #000 | J.I. Morris Company | FF000CE125 |
| Silicone aquarium sealant | Perfecto Manufacturing | 31001 |
| Tin oxide powder | Mama’s Minerals | EQT-TINOX |
| EQUIPMENT | ||
| Glass scribe | Fisher Scientific | 08-675 |
| Dissecting microscope | Carl Zeiss | OPMI-1 FC |
| Electric powered drill | Foredom or Osada | K.1020 (Foredom) or EXL-M40 (Osada) |
| Electrical razor | Wahl | Series 8900 |
| Forceps, Dumont no. 55 | Fine Science Tools | 11255-20 |
| Feedback regulated heat pad | FHC | 40-90-8 (rectal thermistor, 40-90-5D-02; heat pad, 40-90-2-07) |
| Isoflurane vaporizer | Ohmeda | IsoTec4 |
| Pulse oximeter | Starr Life Sciences | MouseOx |
| Screwdriver, miniature | Garret Wade | 26B09.01 |
| Stereotaxic frame | Kopf Instruments | Model 900 (with mouse anesthesia mask and non-rupture ear bars) |
| Surgical scissors, blunt end | Fine Science Tools | 14078-10 |
| Ultrasonic cleaner | Fisher Scientific | 15-335-30 |
Table 2. List of specific reagents, disposables and equipment.
Referências
- Cetin, A. Stereotaxic gene delivery in the rodent brain. Nature Protocols. 1, 3166-3173 (2006).
- Kleinfeld, D., Delaney, K. R. Distributed representation of vibrissa movement in the upper layers of somatosensory cortex revealed with voltage sensitive dyes. Journal of Comparative Neurology. 375, 89-108 (1996).
- Driscoll, J. D., Yuste, R. Quantitative two-photon imaging of blood flow in cortex. Imaging in Neuroscience and Development. , 927-937 (2011).
- Drew, P. J., Shih, A. Y., Kleinfeld, D. Fluctuating and sensory-induced vasodynamics in rodent cortex extends arteriole capacity. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 108, 8473-8473 (2011).
- Mostany, R., Portera-Cailliau, C. A Method for 2-Photon Imaging of Blood Flow in the Neocortex through a Cranial Window. J. Vis. Exp. (12), e678-e678 (2008).
- Zhang, S. Rapid reversible changes in dendritic spine structure in vivo gated by the degree of ischemia. Journal of Neuroscience. 25, 5333-5338 (2005).
- Takano, T. Astrocyte-mediated control of cerebral blood flow. Nature Neuroscience. 9, 260-267 (2006).
- Drew, P. J. Chronic optical access through a polished and reinforced thinned skull. Nature Methods. 7, 981-984 (2010).
- Marker, D. F. A thin-skull window technique for chronic two-photon in vivo imaging of murine microglia in models of neuroinflammation. Journal of Visualized Experiments. (43), e2059-e2059 (2010).
- Feng, G. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. 28, 41-51 (2000).
- Martin, C. Investigating neural-hemodynamic coupling and the hemodynamic response function in the awake rat. Neuroimage. 32, 33-48 (2006).
- Shih, A. Y. Two-photon microscopy as a tool to study blood flow and neurovascular coupling in the rodent brain. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. , (2011).
- Kobat, D. Deep tissue multiphoton microscopy using longer wavelength excitation. Optics Express. 17, 13354-13364 (2009).
- Holtmaat, A. high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window. Nature Protocols. 4, 1128-1144 (2009).
- Xu, H. T. Choice of cranial window type for in vivo imaging affects dendritic spine turnover in the cortex. Nature Neuroscience. 10, 549-551 (2007).
- Nimmerjahn, A., Kirchhoff, F., Helmchen, F. Resting microglial cells are highly dynamic surveillants of brain parenchyma in vivo. Science. 308, 1314-1318 (2005).
- Davalos, D. ATP mediates rapid microglial response to local brain injury in vivo. Nature Neuroscience. 8, 752-758 (2005).
- Ascenzi, A., Fabry, C. Technique for dissection and measurement of refractive index of osteons. The Journal of Biophysical and Biochemical Cytology. 6, 139-142 (1959).
- Stosiek, C. In vivo two-photon calcium imaging of neuronal networks. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 100, 7319-7324 (2003).
- Grinvald, A. Functional architecture of cortex revealed by optical imaging of intrinsic signals. Nature. 324, 361-364 (1986).
- Dunn, A. K. Dynamic imaging of cerebral blood flow using laser speckle. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 21, 195-201 (2001).
- Villringer, A. Capillary perfusion of the rat brain cortex: An in vivo confocal microscopy study. Circulation Research. 75, 55-62 (1994).
- Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248, 73-76 (1990).
- Srinivasan, V. J. Optical coherence tomography for the quantitative study of cerebrovascular physiology. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 31, 1339-1345 (2011).
- Hu, S., Wang, L. V. Photoacoustic imaging and characterization of the microvasculature. Journal of Biomedical Optics. 15, 011101-011101 (2010).
- Flecknell, P. A. . Laboratory animal anesthesia. , (1987).
