使用特定的糖苷酶,以消除通过SDS – PAGE的糖蛋白的糖是一种有价值的的方法来检测蛋白质样品聚糖修改初始糖生物学研究的是一个不错的选择。以下deglycosylation变化可以检测凝胶的流动性的变化或与多糖敏感的试剂染色。
此外共价连接的糖,糖基化,是一个重要的翻译后修饰的蛋白质,可以显着影响,如细 胞粘附分子贩运,清关,和信号转导1-4的过程。在真核生物中,在分泌途径中最常见的糖基化修改,增加共识,天门冬素剩余物(N -连接);或在丝氨酸或苏氨酸残基(O型连锁)(图1 )。在真核生物中是高度保守的N -聚糖合成的起始,而最终产品可以在不同物种间,组织,或蛋白质大大不同。有些聚糖保持未修改“(”高甘露糖N -糖链“),或在高尔基(” 复杂的N -糖链“)进一步处理。更大的多样性是O型聚糖,开始与一个共同的 N -乙酰半乳糖胺(半乳糖胺)残留在动物细胞中,但不同的低等生物 1 。
耳鼻喉科“>蛋白质的糖基化的详细分析本身就是一个领域,需要丰富的资源和专业知识,正确执行。然而,各种可用的酶,删除糖(糖苷)成为可能的糖基化的现状有一个总体思路在一个标准的实验室环境中的蛋白质,在这里我们说明分析模型糖蛋白糖苷酶的使用。重组人绒毛膜促性腺激素β(hCGβ), 它带有两个N -糖链和四个O型聚糖5,该技术只需要简单仪器和典型的消耗品,它可以很容易地适应多种糖蛋白样品的分析。几种酶可用于并行研究的一种糖蛋白。 PNGase F是能够去除几乎所有类型的N -连接聚糖6,7。 为 O -糖链,有没有可用的酶可以切割完整的低聚糖从日E蛋白的骨干。相反,O型聚糖修剪exoglycosidases一个短的核心,是那么容易由 O -糖苷酶删除。蛋白质Deglycosylation结构包含PNGase F,O -糖苷酶,神经氨酸酶(唾液酸),β1- 4半乳糖苷酶和β- N – Acetylglucosaminidase。它是用来同时去除N -糖链和一些O型聚糖8。最后,Deglycosylation混合补充的其他exoglycosidases混合物(α- N – Acetylgalactosaminidase,α1- 2岩藻糖苷酶,α1- 3,6半乳糖苷酶,β1- 3半乳糖苷酶),这有助于消除否则抗单糖,可目前在某些O -聚糖。
SDS-PAGE/Coomasie蓝色是用于可视化蛋白质迁移糖苷酶治疗前后的差异。此外,糖特定的染色方法,ProQ翡翠- 300,显示减少信号聚糖是帅客ssively删除。此协议是专为少量的糖蛋白(0.5%到2微克)的分析,虽然酶deglycosylation可以扩大规模,以适应需要较大的蛋白质数量。
这里介绍的方法使用酶deglycosylation和SDS – PAGE可以提供有价值的信息有关的蛋白糖基化状态,而聚糖特定试剂方便对数据的解释。此协议的目的是为蛋白质糖基化的初步研究,它特别适用于哺乳动物细胞分泌和膜糖蛋白:在这种情况下选择的酶将专门删除所有的 N -糖链, 或N -糖链加上最常见的糖扩大和形成的 O -糖链的核心。糖苷酶具有额外的优势正在温和,用化学deglycosylation方法相比,保持糖和蛋白质的骨干的完整性。
为了阐明入住率(氨基酸是糖化),糖基化的程度,或确定的精细结构的多聚糖,更先进的技术,如米屁股光谱仪,液相色谱仪或核磁共振是必需的。
由于其简单,在这个协议中的几个步骤可以进行调整,替换,和/或合并,以适应不同的实验需要。然而,为了获得结果,可以清楚地解释重要的是要了解它的长处和局限性。首先,特异性和糖苷酶的纯度是至关重要的:只有良好的特点测试蛋白酶和其他污染活动的酶,应使用。不幸的是,没有标准的单位定义为糖苷酶,根据制造商的规格,用户应确定适当的替代。二,谨慎选择的检测是必要的:A)蛋白染色试剂是有用的,只有在一个相对分子质量的重大转变的deglycosylation结果。并不总是得到这样一个明确的结果如下所示。在其他情况下,我们所看到的异常MIdeglycosylation后格拉逊(远远低于预测的分子量,或更慢迁移) 。这种现象是没有很好地理解,但也可以说, 任何在迁移变化是证据表明,该蛋白已deglycosylated B)糖与抗体检测呈现独特的挑战限制其适用性。它已经很难产生一般反聚糖抗体,它们通常是对一个复杂的糖链的目标,这限制了它们的使用提出。此外,一些单克隆抗聚糖抗体显示不受欢迎的交叉反应 10。彗星)凝集素(糖亲和力内在蛋白)是非常适合对糖的检测,加上他们给聚糖结构上的洞察力。然而,并非所有这些有一个狭窄的特异性,很多都只是部分的特点(这意味着他们可能有未知的亲和力)。因此积极的外源凝集素染色提供指示,而不是地理标志的存在证明,VEN糖D)化学标记试剂盒(基于碘酸氧化糖)的首选方法染色所有的糖蛋白,因此非常适合跟随deglycosylation。
处理未知样品时,这是一个很好的做法,包括糖蛋白控制。胎球蛋白是一个现成的N – 和 O -糖蛋白,绒毛膜促性腺激素(两个亚基)也是一个不错的选择。牛血清白蛋白(BSA)可以用来作为阴性对照。但是,应该指出,一些非糖基化蛋白反应轻微的Pro – Q 300翡翠,特别是在高浓度时使用。非糖基化的分子量标准,如在本议定书中使用的预染蛋白质标记,显示锐利带的优势。不仅是这些蛋白质(80 kDa)的反应到临 – Q翡翠300之一的机会。因此,用户可能要运行的一种糖蛋白标准的阶梯,而不是,如Invitroge糖甘蔗N.
最后,简单的凝胶nucleocytosolic糖蛋白(这是一个单一的O型葡萄糖修改)的检测是可能的使用单克隆抗体,沿β- N – Acetylglucosaminidase 特异性控制11。超越了这项技术的描述是这篇文章的范围,但它应该提到糖苷酶在细胞中存在的许多其他糖蛋白和糖复合物的研究是非常有用的工具。一个所有已知的糖基化形式的综合治疗,可以发现在第二版的“糖生物学基础”,可在NCBI的书柜(书架编号:;:20301239关键词NBK1908)免费在线12。
The authors have nothing to disclose.
唐梳
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
Human chorionic gonadotropin β | Sigma Aldrich | C6572 | |
PCR Tubes | VWR | 20170-004 | |
PCR Thermocycler | Applied Biosystems | 4359659 | |
PNGase F | New England Biolabs | P0704 | Supplied with buffers |
Protein Deglycosylation Mix | New England Biolabs | P6039 | Supplied with buffers |
α-N-Acetylglalactosaminidase | New England Biolabs | P0734 | Supplied with buffer |
α1-2 Fucosidase | New England Biolabs | P0724 | Supplied with buffer |
α1-3,6 Galactosidase | New England Biolabs | P0731 | Supplied with buffer |
β1-3 Galactosidase | New England Biolabs | P0726 | Supplied with buffer |
10X Buffer G7 (500 mM Sodium Phosphate) | New England Biolabs | — | Supplied with PNGaseF or Degl Mix |
10X Glycoprotein Denaturing Buffer (5% SDS, 400 mM DTT) | New England Biolabs | — | Supplied with PNGaseF or Degl Mix |
10% NP-40 | New England Biolabs | — | Supplied with PNGaseF or Degl Mix |
3X SDS loading buffer (187.5 mM Tris-HCl pH 6.8, 6% SDS, 30% glycerol, 0.03% bromophenol blue) | New England Biolabs | B7703 | Supplied with 1.25M DTT |
ColorPlus Prestained Protein Marker | New England Biolabs | P7709 | |
10-20% Tris-Glycine Multigel | Cosmo Bio Co. | DCB-414893 | |
Cassette Electrophoresis Unit | Cosmo Bio Co. | DCB-303111 | |
Electrophoresis Power Supply EPS 301 | GE Healthcare | 18-1130-01 | |
Pro-Q Emerald 300 Glycoprotein Stain Kit | Invitrogen | P-21857 | |
Brilliant Blue R | Sigma Aldrich | B0149 | |
AlphaImager HP System | Cell Biosciences | 92-13823-00 |