監督分化アプローチで細胞を産生する膵臓インスリンにヒト胚性幹細胞の内皮細胞の共培養を仲介する成熟
Summary
現在の研究では、ヒト胚性幹細胞の膵臓の分化誘導の指示分化のアプローチについて説明します。大きな意義のインスリン発現する細胞に膵臓の前駆細胞由来のヒト胚性幹細胞の発見、その内皮細胞の共培養を仲介する成熟である。
Abstract
胚性幹細胞（ESC）は、2つの主な特徴を持っている：彼らはいつまでもこのように複数の系統に分化する可能性を有する未分化の状態でin vitroで増殖させ、彼らが多能性であることができます。このような性質は、細胞ベースの治療と再生治療のアプリケーション1のESCのは非常に魅力的です。しかし、実現するための最大限の可能性のために細胞は骨の折れる作業である成熟した機能的な表現型に分化する必要があります。細胞分化を誘導するのに有望なアプローチは密接にin vitroでの設定で器官形成のパスを模倣することである。膵臓の開発は、肝臓や膵臓など、いくつかの臓器に開発することができます内胚葉から始まる、特定のステージ2で発生することが知られています。内胚葉誘導は4月7日 、いくつかの成長因子との組み合わせで3アクチビンの添加によりリンパ節転移経路の変調によって達成することができる</> supの。胚体内胚葉細胞は、シクロパミン8の添加によってin vitroで達成することができますソニック·ザ·ヘッジホッグ阻害の阻害による膵のコミットメントを受けています。膵臓の成熟は、ノッチシグナル伝達の阻害を含むいくつかの並列イベントによって媒介される、3次元のクラスタに膵臓の前駆細胞の凝集、血管新生の誘導、いくつかの名前を指定する。これまで最も成功したESC由来の膵臓前駆細胞の体外成熟によってDAPT補充9でNotchシグナル伝達の阻害を介して達成されている。成功したものの、減少している機能を持つ成熟した表現型の低収率でこの結果。以下の研究領域は、ますます、生体内の膵島成熟10,11の重要な要因として評価されている膵臓の成熟にシグナリング内皮細胞の効果である。
現在の研究では、endothelのような効果を探るIAL細胞は膵島様細胞をインスリン産生にヒトESC由来の膵臓前駆細胞の成熟にシグナル伝達。我々は、ヒトESCが最初にPI3K経路を阻害するとともに、アクチビンによって内胚葉に向かって誘導される多段階の指示分化プロトコルを報告する。内胚葉細胞の膵臓の仕様は、レチノイン酸を添加することによりレチノイド誘導とともに、シクロパミンによってソニック·ザ·ヘッジホッグシグナル伝達の阻害によって達成されます。成熟の最終段階は、共培養の構成によって達成さ内皮細胞のシグナル伝達によって誘導される。いくつかの内皮細胞の共培養でテストされているが、ここに我々は、主に分析を容易にするために、ラット心臓微小血管内皮細胞（RHMVEC）で我々のデータを提示します。
Protocol
Discussion
膵臓の開発中に、差別膵臓細胞では、大動脈からの内皮細胞と近接している。さらに、膵島は、血糖と膵島ホルモンの迅速な交換を促進するために密に血管があります。これらの事実を考えれば、内皮細胞が膵臓器官形成の過程において重要な役割を果たしていることは驚くべきことではない。膵臓の開発中の血管内皮細胞の重要性はますます高く評価されている間、胚細胞のin vitro分化<…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我々は116520 DP2 NIHの新しいイノベーター賞とORAUラルフポウジュニア教員強化賞からのサポートを認める。
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Concentrations |
| mTeSR1 (with supplement) | Stem cell Technologies | 5850 | |
| hESC qualified matrigel | BD Biosciences | 354277 | |
| DMEM:F12 | Invitrogen | 11330-032 | |
| MCDB-131 | Invitrogen | 10372019 | |
| MCDB-131 (Complete) | VEC Technologies | MCDB-131 | |
| B27 Supplement | Invitrogen | 17504044 | |
| Activin A | R&D | 338-AC | 100ng/ml |
| Wortmannin | Invitrogen | W3144 | 1μM |
| KAAD-Cyclopamie | Sigma-Aldrich | C4116 | 0.2μM |
| All-Trans Retinoic Acid | Sigma-Aldrich | R2625 | 2μM |
| DAPT | Sigma-Aldrich | D5942 | 30μM |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636 | 10 mM |
| Sodium Selenite | Sigma-Aldrich | S5261 | 30 nM |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I1882 | 25 μg/ml |
| Transferrin | Sigma-Aldrich | T8158 | 50 μg/ml |
| EGF | R&D | 236-EG | 10ng/ml |
| EndoGro | VEC Technologies | ENDOGRO | 10mg |
| Heparin | Sigma-Aldrich | H3149 | 90μg/ml |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H0888 | 1μg/ml |
| NucleoSpin RNA II | Macherey Nagel | 740955 | |
| ImProm II reverse transcription System | Promega | A3800 | |
| Brilliant II SYBR Green QPCR master mix | Straragene | 600548 | |
| Sox17 goat polyclonal IgG | Santa Cruz | sc-17355 | 1/500 |
| PDX1 goat polyclonal IgG | Santa Cruz | sc-14662 | 1/500 |
| C-Peptide Rabbit polyclonal | Cell Signaling | 4593 | 1/500 |
| Alexa Fluor 488 donkey anti-rabbit IgG | Invitrogen | A-21206 | 1/1000 |
| Alexa Fluor 647 donkey anti-goat IgG | Invitrogen | A-21447 | 1/1000 |
Table 2. Reagents and Kits.
Referências
- De Vos, J., Assou, S., Tondeur, S., Dijon, M., Hamamah, S. Les cellules souches embryonnaires humaines : de la transgression de l’embryon humain á la médecine régénératrice de demain. Gynécologie Obstétrique & Fertilité. 37, 620-626 (2009).
- Murtaugh, L. C., Melton, D. A. Genes, Signals, and Lineages in Pancreas Development. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 19, 71-89 (2003).
- Kubo, A., Shinozaki, K., Shannon, J. M., Kouskoff, V., Kennedy, M., Woo, S., Fehling, H. J., Keller, G. Development of definitive endoderm from embryonic stem cells in culture. Development. 131, 1651-1662 (2004).
- D’Amour, K. A., Bang, A. G., Eliazer, S., Kelly, O. G., Agulnick, A. D., Smart, N. G., Moorman, M. A., Kroon, E., Carpenter, M. K., Baetge, E. E. Production of pancreatic hormone-expressing endocrine cells from human embryonic stem cells. Nat. Biotech. 24, 1392-1401 (2006).
- Zhang, D., Jiang, W., Liu, M., Sui, X., Yin, X., Chen, S., Shi, Y., Deng, H. Highly efficient differentiation of human ES cells and iPS cells into mature pancreatic insulin-producing cells. Cell Res. 19, 429-438 (2009).
- Basma, H., Soto-Gutiérrez, A., Yannam, G. R., Liu, L., Ito, R., Yamamoto, T., Ellis, E., Carson, S. D., Sato, S., Chen, Y., Muirhead, D. Differentiation and Transplantation of Human Embryonic Stem Cell-Derived Hepatocytes. Gastroenterology. 136, 990-999 (2009).
- Phillips, B. W., Hentze, H., Rust, W. L., Chen, Q. -. P., Chipperfield, H., Tan, E. -. K., Abraham, S., Sadasivam, A., Soong, P. L., Wang, S. T., Lim, R., Sun, W., Colman, A., Dunn, N. R. Directed Differentiation of Human Embryonic Stem Cells into the Pancreatic Endocrine Lineage. Stem Cells and Development. 16, 561-578 (2007).
- Kim, S. K., Melton, D. A. Pancreas development is promoted by cyclopamine, a Hedgehog signaling inhibitor. Proceedings of the National Academy of Sciences. 95, 13036-13041 (1998).
- Docherty, K. Growth and development of the islets of Langerhans: implications for the treatment of diabetes mellitus. Current Opinion in Pharmacology. 1, 641-649 (2001).
- Nikolova, G., Jabs, N., Konstantinova, I., Domogatskaya, A., Tryggvason, K., Sorokin, L., Fässler, R., Gu, G., Gerber, H. -. P., Ferrara, N., Melton, D. A. The Vascular Basement Membrane: A Niche for Insulin Gene Expression and [beta]> Cell Proliferation. Developmental Cell. 10, 397-405 (2006).
- Yoshitomi, H., Zaret, K. S. Endothelial cell interactions initiate dorsal pancreas development by selectively inducing the transcription factor Ptf1a. Development. 131, 807-817 (2004).
- Osafune, K., Caron, L., Borowiak, M., Martinez, R. J., Fitz-Gerald, C. S., Sato, Y., Cowan, C. A., Chien, K. R., Melton, D. A. Marked differences in differentiation propensity among human embryonic stem cell lines. Nat. Biotech. 26, 313-315 (2008).
- Banerjee, I., Sharma, N., Yarmush, M. Impact of co-culture on pancreatic differentiation of embryonic stem cells. J. Tissue Eng. Regen. Med. 5, 313-323 (2010).
