Endotelcell Co-kultur förmedlar Mognad av mänskliga embryonala stamceller att producera insulin från bukspottkörteln celler i en riktad differentiering strategi
Summary
Den aktuella studien beskriver en riktad differentiering strategi att framkalla bukspottkörteln differentiering av mänskliga embryonala stamceller. Av stor betydelse är upptäckten att endotelcell samodling förmedlar mognad av mänskliga embryonala stamceller som härrör pankreas stamceller till insulinproducerande celler som uttrycker.
Abstract
Embryonala stamceller (ESC) har två huvudsakliga egenskaper: de kan vara på obestämd tid förökas in vitro i ett odifferentierat tillstånd och de är pluripotenta, vilket har potential att differentieras till flera linjer. Sådana egenskaper gör ekonomiska och sociala råd extremt attraktiv för cell-baserad terapi och regenerativ program behandling 1. Men för sin fulla potential skall kunna förverkligas cellerna måste differentieras till mogna och funktionella fenotyper, vilket är en skrämmande uppgift. En lovande metod att framkalla cellulär differentiering är att efterlikna vägen organogenesen i de vitro inställningen. Pankreatisk utveckling är känd att uppträda i olika stadier 2, med början med endoderm, som kan utvecklas till flera organ, inkluderande lever och pankreas. Endoderm induktion kan uppnås genom modulering av den nodala väg genom tillsats av Aktivin A 3 i kombination med flera tillväxtfaktorer 4-7 </sup>. Slutgiltiga endoderm celler genomgår sedan pankreatisk engagemang av hämning av Sonic hedgehog hämning, som kan uppnås in vitro genom tillsats av cyklopamin 8. Pancreatic mognad förmedlas av flera parallella händelser inklusive hämning av skåran signalering, sammanslagning av pankreas föregångare till 3-dimensionella kluster, induktion av vaskularisering, för att nämna några. Den överlägset mest framgångsrika in vitro mognaden av ESC härledda celler i bukspottkörteln stamceller har uppnåtts genom hämning av skåran signalering av DAPT tillskott 9. Även framgångsrika, resulterar detta i lågt utbyte av den mogna fenotypen med reducerad funktionalitet. En mindre studerat område är effekten av endotelceller signalering i bukspottkörteln mognad, som alltmer uppskattad som en viktig bidragande faktor i in-vivo pankreasö mognad 10,11.
Den aktuella studien undersöker en sådan effekt av endotelIAL cell signalering i mognaden av humana ESC härledda celler i bukspottkörteln progenitorceller i insulinproducerande ö-liknande celler. Vi rapporterar flera steg riktad differentiering protokoll där de mänskliga ekonomiska och sociala råden först induceras mot endoderm med Aktivin A tillsammans med hämning av PI3K väg. Pankreatisk specifikation av endoderm celler uppnås genom inhibering av sonisk Hedgehog-signalering genom Cyklopamin tillsammans med retinoiden induktion genom tillsats av retinsyra. Slutskedet av mognad induceras genom endotel-cell-signalering uppnås genom en samodling konfiguration. Medan flera endotelceller har testats i samodling, här presenterar vi våra data med mikrovaskulära råtthjärta endotelceller (RHMVEC), främst för att underlätta analysen.
Protocol
Discussion
Under bukspottkörtelns utveckling, differentierande pankreasceller är i närheten med endotelceller från aorta, dessutom pankreasöar är tätt vaskulariserade att främja snabbt utbyte av blodglukos och hormoner ö. Med tanke på dessa fakta, är det inte överraskande att endotelceller spela en viktig roll i processen för pankreatiskt organogenes. Även om betydelsen av endoteliala celler under pankreatisk utveckling används alltmer uppenbart, är dess roll i in vitro-differentiering av embryonala celler…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi erkänner stöd från NIH New Innovator Award DP2 116.520 och ORAU Ralph Powe Junior Faculty Enhancement Award.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Concentrations |
| mTeSR1 (with supplement) | Stem cell Technologies | 5850 | |
| hESC qualified matrigel | BD Biosciences | 354277 | |
| DMEM:F12 | Invitrogen | 11330-032 | |
| MCDB-131 | Invitrogen | 10372019 | |
| MCDB-131 (Complete) | VEC Technologies | MCDB-131 | |
| B27 Supplement | Invitrogen | 17504044 | |
| Activin A | R&D | 338-AC | 100ng/ml |
| Wortmannin | Invitrogen | W3144 | 1μM |
| KAAD-Cyclopamie | Sigma-Aldrich | C4116 | 0.2μM |
| All-Trans Retinoic Acid | Sigma-Aldrich | R2625 | 2μM |
| DAPT | Sigma-Aldrich | D5942 | 30μM |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636 | 10 mM |
| Sodium Selenite | Sigma-Aldrich | S5261 | 30 nM |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I1882 | 25 μg/ml |
| Transferrin | Sigma-Aldrich | T8158 | 50 μg/ml |
| EGF | R&D | 236-EG | 10ng/ml |
| EndoGro | VEC Technologies | ENDOGRO | 10mg |
| Heparin | Sigma-Aldrich | H3149 | 90μg/ml |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H0888 | 1μg/ml |
| NucleoSpin RNA II | Macherey Nagel | 740955 | |
| ImProm II reverse transcription System | Promega | A3800 | |
| Brilliant II SYBR Green QPCR master mix | Straragene | 600548 | |
| Sox17 goat polyclonal IgG | Santa Cruz | sc-17355 | 1/500 |
| PDX1 goat polyclonal IgG | Santa Cruz | sc-14662 | 1/500 |
| C-Peptide Rabbit polyclonal | Cell Signaling | 4593 | 1/500 |
| Alexa Fluor 488 donkey anti-rabbit IgG | Invitrogen | A-21206 | 1/1000 |
| Alexa Fluor 647 donkey anti-goat IgG | Invitrogen | A-21447 | 1/1000 |
Table 2. Reagents and Kits.
Referências
- De Vos, J., Assou, S., Tondeur, S., Dijon, M., Hamamah, S. Les cellules souches embryonnaires humaines : de la transgression de l’embryon humain á la médecine régénératrice de demain. Gynécologie Obstétrique & Fertilité. 37, 620-626 (2009).
- Murtaugh, L. C., Melton, D. A. Genes, Signals, and Lineages in Pancreas Development. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 19, 71-89 (2003).
- Kubo, A., Shinozaki, K., Shannon, J. M., Kouskoff, V., Kennedy, M., Woo, S., Fehling, H. J., Keller, G. Development of definitive endoderm from embryonic stem cells in culture. Development. 131, 1651-1662 (2004).
- D’Amour, K. A., Bang, A. G., Eliazer, S., Kelly, O. G., Agulnick, A. D., Smart, N. G., Moorman, M. A., Kroon, E., Carpenter, M. K., Baetge, E. E. Production of pancreatic hormone-expressing endocrine cells from human embryonic stem cells. Nat. Biotech. 24, 1392-1401 (2006).
- Zhang, D., Jiang, W., Liu, M., Sui, X., Yin, X., Chen, S., Shi, Y., Deng, H. Highly efficient differentiation of human ES cells and iPS cells into mature pancreatic insulin-producing cells. Cell Res. 19, 429-438 (2009).
- Basma, H., Soto-Gutiérrez, A., Yannam, G. R., Liu, L., Ito, R., Yamamoto, T., Ellis, E., Carson, S. D., Sato, S., Chen, Y., Muirhead, D. Differentiation and Transplantation of Human Embryonic Stem Cell-Derived Hepatocytes. Gastroenterology. 136, 990-999 (2009).
- Phillips, B. W., Hentze, H., Rust, W. L., Chen, Q. -. P., Chipperfield, H., Tan, E. -. K., Abraham, S., Sadasivam, A., Soong, P. L., Wang, S. T., Lim, R., Sun, W., Colman, A., Dunn, N. R. Directed Differentiation of Human Embryonic Stem Cells into the Pancreatic Endocrine Lineage. Stem Cells and Development. 16, 561-578 (2007).
- Kim, S. K., Melton, D. A. Pancreas development is promoted by cyclopamine, a Hedgehog signaling inhibitor. Proceedings of the National Academy of Sciences. 95, 13036-13041 (1998).
- Docherty, K. Growth and development of the islets of Langerhans: implications for the treatment of diabetes mellitus. Current Opinion in Pharmacology. 1, 641-649 (2001).
- Nikolova, G., Jabs, N., Konstantinova, I., Domogatskaya, A., Tryggvason, K., Sorokin, L., Fässler, R., Gu, G., Gerber, H. -. P., Ferrara, N., Melton, D. A. The Vascular Basement Membrane: A Niche for Insulin Gene Expression and [beta]> Cell Proliferation. Developmental Cell. 10, 397-405 (2006).
- Yoshitomi, H., Zaret, K. S. Endothelial cell interactions initiate dorsal pancreas development by selectively inducing the transcription factor Ptf1a. Development. 131, 807-817 (2004).
- Osafune, K., Caron, L., Borowiak, M., Martinez, R. J., Fitz-Gerald, C. S., Sato, Y., Cowan, C. A., Chien, K. R., Melton, D. A. Marked differences in differentiation propensity among human embryonic stem cell lines. Nat. Biotech. 26, 313-315 (2008).
- Banerjee, I., Sharma, N., Yarmush, M. Impact of co-culture on pancreatic differentiation of embryonic stem cells. J. Tissue Eng. Regen. Med. 5, 313-323 (2010).
