בידוד של תאים אפיתל החלב של תלת ממדי תאים משולבים תרבות משותפת אליפטית

Summary

השיטה פשוטה מתוארת לניתוח השפעות fibroblasts רקמה על תאים אפיתל הכרוכים בכך. השילוב של שיטה זו, תלת מימדי התרבות רקמת יכול להקל על ניתוח של תאים לאחר במנותק מן 3D. הטכניקה היא החלה על תאים שונים של פוטנציאל ממאיר, המאפשר לימוד שיטתי של השפעות stroma הגידול הקשורים על תאים סרטניים.

Abstract

למרות מאמצים אדירים הושקעו בזיהוי מסלולי איתות ומולקולות מעורבים בהתנהגויות סלולריים רגילים וממאירים ^1-2, את רוב העבודה הדבר נעשה באמצעות קלאסיות דו מימדי תרבות דגמים סלולריים, המאפשרים מניפולציה התא קל. זה הפך להיות ברור כי מסלולי איתות תאיים מושפעים על ידי כוחות תאיים, כולל ממדיות ואת שטח פני התא המתח ^3-4. גישות רבות ננקטו כדי לפתח דגמים תלת ממדיים, כי יותר נכון לייצג את הרקמה ביולוגית ארכיטקטורת ^3. בעוד המודלים האלה לשלב ממדיות רב מדגיש אדריכליים, חקר את ההשפעות הנובעות מכך על תאים הוא קליל פחות בתרבות דו מימדי רקמות בשל המגבלות של המודלים ואת הקושי להפיק תאים לצורך ניתוח מאוחר יותר.

תפקיד חשוב של microenvironment סביב גידולים tumorigenesis והתנהגות הגידול אניזה הופך מוכר יותר ויותר ^4. Stroma הגידול מורכב מספר רב של סוגי תאים ומולקולות תאיים. במהלך התפתחות גידולים קיימים אותות דו כיוונית בין תאים סרטניים ותאים סטרומה ^5. אף על פי כמה גורמים שהשתתפו האבולוציה שיתוף גידולים stroma זוהו, עדיין יש צורך לפתח טכניקות פשוטות באופן שיטתי לזהות וללמוד מערך מלא של אותות אלה ^6. Fibroblasts הם סוג התא הנפוץ ביותר ברקמות סטרומה רגילים או גידולים הקשורים, ולתרום בתצהיר ותחזוקה של קרום המרתף גורמי גדילה paracrine ^7.

קבוצות רבות השתמשו בשלוש מערכות תרבות מימדי כדי לחקור את תפקידה של fibroblasts על תפקודים תאיים שונים, לרבות תגובת הגידול לטיפולים, גיוס של תאים חיסוניים, מולקולות איתות, התפשטות, אפופטוזיס, אנגיוגנזה, ופלישה ^8-15. יש לנו אופטימיזציה שיטה פשוטה התחתessing את ההשפעות של fibroblasts החלב על תאים אפיתל החלב באמצעות מודל זמין מסחרית תאי מטריקס ליצור תלת ממדי תרבויות של אוכלוסיות תאים מעורבים (עמיתים תרבויות) ^16-22. עם תרבות משותפת המשך התאים יוצרים spheroids עם אשכולות fibroblasts בפנים ואת לתאי האפיתל בעיקר על הצד החיצוני של spheroids את ויוצרים רב תאיים תחזיות לתוך מטריקס. מניפולציה של fibroblasts שמוביל הפולשנות שינו תא אפיתל ניתן לכמת בקלות על ידי שינויים מספרים באורך של ²³ תחזיות אפיתל. יתר על כן, אנו פיתחו שיטה לבודד תאים אפיתל מתוך תרבות משותפת תלת מימדי המאפשר ניתוח של ההשפעות של חשיפה פיברובלסטים על התנהגות אפיתל. מצאנו כי ההשפעות של תרבות משותפת להימשך שבועות לאחר בידוד תא אפיתל, המתיר מספיק זמן כדי לבצע מבחני מרובים. שיטה זו ניתנת להתאמה של התאיםשינוי פוטנציאל ממאיר לא דורש ציוד מיוחד. טכניקה זו מאפשרת הערכה מהירה של במודלים תאים במבחנה בתנאים רבים, את התוצאות המתאימות ניתן להשוות ברקמות ב vivo בבעלי חיים, כמו גם דגימות רקמה אדם.

Protocol

1. הקמת תלת ממדי שיתופי תרבויות יום לפני להקים את שיתוף תרבויות, הסר Matrigel מהמקפיא להפשרה על קרח במקרר 4 ° C למשך הלילה. ביום הניסוי, להכין את המדיום לתרבות משותפת, אשר תואמים את המדיום של תאים א?…

Discussion

השיטה המוצגת כאן מייצגת גישה פשוטה לניתוח השפעות fibroblasts סטרומה בתאי אפיתל, כולל תאים סרטניים. היא מאפשרת אינטראקציה תאים תאים ישירה בהקשר תלת מימדי נתמך על ידי מטריקס במרתף תאי הממברנה, תוך מתן אפשרות חילוץ קל של תאים מהמטריצה ​​לניתוח נוסף. זה יכול להיות מיושם על מח…

Materials

Name of reagent	Company	Catalogue number	Comments
BD Matrigel	BD Biosciences	356237	Phenol-red free
Hyclone Classical Liquid Medium: DMEM F12	ThermoScientific	SH30023.01
Hyclone Bovine Calf Serum	ThermoScientific	SH3007303
Insulin	EMD Chemicals	407709	Dissolve in 0.005N HCl; 0.22 μM filter
Hydrocortisone	Sigma-Aldrich	H4001	Dissolve in 50% EtOH; 0.22 μM filter
EGF	Sigma-Aldrich	E9644	Dissolve in 10mM acetic acid; 0.22 μM filter