Aislamiento de células epiteliales mamarias de tridimensional mixto de células Esferoide Co-cultura

Summary

Un método simple se describe para analizar los efectos de los fibroblastos del tejido en las células epiteliales asociados. La combinación de este método y tridimensional cultivo de tejidos puede facilitar el análisis de las células después del aislamiento de 3D. La técnica es aplicable a las células de diferentes potencial maligno, permitiendo el estudio sistemático de los efectos de estroma asociado al tumor en las células tumorales.

Abstract

Mientras que los enormes esfuerzos han ido a la identificación de vías de señalización y las moléculas que intervienen en los comportamientos de células normales y malignas ^1-2, gran parte de este trabajo se ha hecho con clásicos bidimensionales modelos de cultivo celular, que permiten la manipulación de células fácil. Ha quedado claro que las vías de señalización intracelulares se ven afectados por las fuerzas extracelulares, incluyendo la dimensionalidad y la tensión de la superficie celular ^3-4. Múltiples enfoques se han tomado para desarrollar modelos en tres dimensiones que representan con mayor precisión la arquitectura biológica del tejido ^3. Si bien estos modelos incorporan la multidimensionalidad y las tensiones arquitectónicas, el estudio de los consiguientes efectos sobre las células es menos fácil que en el cultivo de tejidos en dos dimensiones debido a las limitaciones de los modelos y la dificultad en la extracción de las células para su posterior análisis.

El importante papel del microambiente alrededor de los tumores en la tumorigénesis y el comportamiento del tumors cada vez más reconocido ^4. Estroma del tumor se compone de múltiples tipos de células y moléculas extracelulares. Durante el desarrollo del tumor hay señales bidireccionales entre las células tumorales y las células del estroma ^5. Aunque algunos de los factores que participan en el tumor de estroma-co-evolución han sido identificados, todavía hay una necesidad de desarrollar técnicas sencillas para identificar de forma sistemática y estudiar toda la gama de estos ⁶ señales. Los fibroblastos son el tipo de célula más abundante en los tejidos normales o estroma del tumor asociado, y contribuir a la deposición y el mantenimiento de la membrana basal y factores de crecimiento paracrinos ^7.

Muchos grupos han utilizado tres sistemas de cultivo de dimensiones para estudiar el papel de los fibroblastos en varias funciones celulares, incluyendo la respuesta del tumor a los tratamientos, el reclutamiento de células inmunes, las moléculas de señalización, proliferación, la apoptosis, la angiogénesis y la invasión de ^8-15. Hemos optimizado un método sencillo para el culoessing los efectos de los fibroblastos mamarias en células epiteliales mamarias utilizando un modelo de matriz extracelular comercialmente disponible para crear tridimensionales cultivos de las poblaciones de células mixtas (co-cultivos) ^16-22. Con continua co-cultivo de las células formar esferoides con la agrupación fibroblastos en el interior y las células epiteliales en gran medida en el exterior de los esferoides y formando multicelulares proyecciones en la matriz. La manipulación de los fibroblastos que conduce a la invasividad de las células epiteliales alterados pueden ser fácilmente cuantificados por cambios en el número y la longitud de las proyecciones epiteliales ^23. Además, hemos ideado un método para aislar células epiteliales de tres dimensiones de co-cultivo que facilita el análisis de los efectos de la exposición de fibroblastos en el comportamiento epitelial. Hemos encontrado que los efectos de co-cultivo persistir durante semanas después del aislamiento de células epiteliales, permitiendo tiempo suficiente para realizar ensayos múltiples. Este método es adaptable a las células devariable potencial maligno y no requiere equipo especializado. Esta técnica permite la evaluación rápida de los modelos de células in vitro bajo condiciones múltiples, y los resultados correspondientes se pueden comparar con los modelos in vivo de tejidos animales, así como muestras de tejidos humanos.

Protocol

1. El establecimiento de tres dimensiones Co-culturas El día antes de establecer la co-culturas, retire el Matrigel del congelador y descongele el hielo en un refrigerador de 4 ° C durante la noche. En el día del experimento, preparar el medio para el co-cultivo, que corresponde al medio para las células epiteliales que se utilizarán (medio HMEC en este ejemplo: DME/F12 medio con 10% de suero bovino ternero, 5 ug / ml de insulina , 1 mg / ml de hidrocortisona, y 1 ng / ml de EGF). Mantener el m…

Discussion

El método aquí presentado representa un método sencillo para analizar los efectos de los fibroblastos del estroma de las células epiteliales, incluyendo las células tumorales. Permite directo célula-célula interacción dentro de un contexto tridimensional apoyada por la matriz extracelular de la membrana basal, al tiempo que permite una fácil extracción de las células de la matriz para su posterior análisis. Esto se puede aplicar al estudio de la estroma asociado al tumor, como fibroblastos de líneas puede s…

Materials

Name of reagent	Company	Catalogue number	Comments
BD Matrigel	BD Biosciences	356237	Phenol-red free
Hyclone Classical Liquid Medium: DMEM F12	ThermoScientific	SH30023.01
Hyclone Bovine Calf Serum	ThermoScientific	SH3007303
Insulin	EMD Chemicals	407709	Dissolve in 0.005N HCl; 0.22 μM filter
Hydrocortisone	Sigma-Aldrich	H4001	Dissolve in 50% EtOH; 0.22 μM filter
EGF	Sigma-Aldrich	E9644	Dissolve in 10mM acetic acid; 0.22 μM filter