Isolamento de células epiteliais mamárias de tridimensional Mixed-célula esferoidal co-cultura

Summary

Um método simples é descrita para analisar os efeitos da fibroblastos de tecido em associadas células epiteliais. A combinação deste método eo tridimensional de cultura de tecido pode facilitar a análise das células após o isolamento a partir de 3D. A técnica é aplicável a células de diferentes potencial maligno, permitindo estudo sistemático dos efeitos de estroma associado ao tumor em células tumorais.

Abstract

Enquanto os esforços enormes ter ido para identificar vias de sinalização e moléculas envolvidos em comportamentos de células normais e malignas ^1-2, muito desse trabalho tem sido feito utilizando clássicos modelos bidimensionais de cultura de células, que permitem a manipulação de células fácil. Tornou-se claro que as vias de sinalização intracelulares são afetados por forças extracelulares, incluindo dimensionalidade e tensão da superfície da célula ^3-4. Várias abordagens têm sido tomadas para desenvolver modelos tridimensionais que representam mais precisamente arquitetura biológica tecido ^3. Embora estes modelos incorporam multidimensionalidade e sublinha arquitetônicas, estudo de consequentes efeitos sobre células é menos fácil do que no bidimensional cultura de tecidos, devido às limitações dos modelos e da dificuldade em extrair células para análise posterior.

O importante papel do microambiente em torno de tumores na tumorigênese e comportamento tumoral iEstá se tornando cada vez mais reconhecida ^4. Estroma tumoral é composto por vários tipos de células e moléculas extracelulares. Durante o desenvolvimento do tumor existem sinais bidireccionais entre as células tumorais e células estromais ^5. Apesar de alguns factores que participam no tumor-estroma co-evolução foram identificados, há ainda uma necessidade de desenvolver técnicas simples para identificar sistematicamente e estudar a matriz completa destes ⁶ sinais. Os fibroblastos são o tipo de célula mais abundante no normais ou associado ao tumor tecidos do estroma, e contribuir para a deposição e manutenção da membrana basal e factores de crescimento parácrinos ^7.

Muitos grupos têm utilizado sistemas de cultura de três dimensões para estudar o papel de fibroblastos em várias funções celulares, incluindo a resposta do tumor à terapias, o recrutamento de células imunitárias, as moléculas de sinalização, a proliferação, a apoptose, angiogénese e invasão ^8-15. Nós otimizamos um método simples para burroessing os efeitos de fibroblastos mamarias em células epiteliais mamárias utilizando um modelo de matriz extracelular comercialmente disponível para criar tridimensionais culturas de populações de células mistas (co-culturas) ^16-22. Com continuada co-cultura das células formam esferóides com a aglomeração fibroblastos no interior e as células epiteliais em grande parte, no exterior dos esferóides e formando multicelulares projecções na matriz. Manipulação dos fibroblastos que leva a capacidade de invasão de células epiteliais alteradas pode ser facilmente quantificado por alterações no número e comprimento das projecções epiteliais ^23. Além disso, desenvolveram um método para isolamento de células epiteliais de tridimensional co-cultura que facilita a análise dos efeitos da exposição de fibroblastos no comportamento epitelial. Verificou-se que os efeitos da co-cultura persistir durante semanas após o isolamento das células epiteliais, permitindo tempo suficiente para realizar os ensaios múltiplos. Este método é adaptável a células devariando potencial maligno e não requer equipamento especializado. Esta técnica permite a avaliação rápida em modelos de células in vitro sob várias condições, e os resultados correspondentes podem ser comparados com modelos animais in vivo de tecidos, bem como amostras de tecidos humanos.

Protocol

1. Estabelecer tridimensionais Co-culturas No dia anterior, que estabelece os co-culturas, remover o Matrigel do congelador e descongelamento em gelo em um 4 ° C frigorífico durante a noite. No dia da experiência, preparar o meio de co-cultura, o que corresponde à média para as células epiteliais para ser utilizados (HMEC médio neste exemplo: DME/F12 meio com 10% soro de vitelo, 5 ug / mL de insulina , 1 ug / mL de hidrocortisona, e 1 ng / mL EGF). Manter o meio em gelo horas, pelo menos, 1 a…

Discussion

O método aqui apresentado representa uma abordagem simples para analisar os efeitos de fibroblastos estromais em células epiteliais, incluindo as células tumorais. Ela permite a interacção célula-célula directa dentro de um contexto tridimensional suportado por matriz extracelular da membrana basal, enquanto permite a extracção fácil de células a partir da matriz para análise posterior. Isto pode ser aplicada ao estudo de estroma associado ao tumor, como linhas de fibroblastos podem ser manipuladas para afec…

Materials

Name of reagent	Company	Catalogue number	Comments
BD Matrigel	BD Biosciences	356237	Phenol-red free
Hyclone Classical Liquid Medium: DMEM F12	ThermoScientific	SH30023.01
Hyclone Bovine Calf Serum	ThermoScientific	SH3007303
Insulin	EMD Chemicals	407709	Dissolve in 0.005N HCl; 0.22 μM filter
Hydrocortisone	Sigma-Aldrich	H4001	Dissolve in 50% EtOH; 0.22 μM filter
EGF	Sigma-Aldrich	E9644	Dissolve in 10mM acetic acid; 0.22 μM filter