Chromatin Chromatin सहभागिता मानचित्रण और प्रतिलेखन विनियमन समझना के लिए बनती अंत टैग अनुक्रमण (Chia पीईटी) के साथ इंटरेक्शन विश्लेषण

Summary

Chromatin इंटरेक्शन विश्लेषण बनती अंत टैग अनुक्रमण (Chia पीईटी) के लिए एक विधि है<em> डी Novo</em> Chromatin बातचीत के transcriptional नियंत्रण की बेहतर समझ के लिए, पता लगाने.

Abstract

जीनोम तीन आयामी संरचना में आयोजित कर रहे हैं, माइक्रोन आकार परमाणु ⁷ रिक्त स्थान के अंदर उच्च आदेश ^{रचना, 2, 12 को} गोद लेने. इस तरह के आर्किटेक्चर यादृच्छिक नहीं हैं और जीन प्रमोटरों और नियामक तत्वों ^{13 के} बीच बातचीत शामिल हैं. प्रतिलेखन कारकों के विशिष्ट विनियामक दृश्यों के बंधन प्रतिलेखन विनियमन और समन्वय ^{1, 14} के एक नेटवर्क के बारे में लाता है.

Chromatin इंटरेक्शन विश्लेषण बनती अंत टैग अनुक्रमण (Chia पीईटी) के लिए इन उच्च आदेश chromatin संरचना ^5,6 की पहचान करने के लिए विकसित किया गया था. कोशिकाओं को तय कर रहे हैं और बातचीत loci सहसंयोजक डीएनए प्रोटीन पार लिंक द्वारा कब्जा कर रहे हैं. गैर विशिष्ट शोर को कम करने के लिए और जटिलता को कम करने के रूप में के रूप में अच्छी तरह से chromatin बातचीत विश्लेषण की विशिष्टता को बढ़ाने, chromatin immunoprecipitation (चिप) विशिष्ट प्रोटीन कारकों के खिलाफ निकटता ligation से पहले ब्याज की chromatin टुकड़े को समृद्ध करने के लिए प्रयोग किया जाता है. आधा linkers शामिल Ligation बाद में डीएनए व्यक्तिगत chromatin परिसरों के भीतर एक साथ tethered टुकड़े के जोड़े के बीच सहसंयोजक लिंक रूपों. flanking आधा linkers में MmeI प्रतिबंध एंजाइम साइटों बनती अंत टैग MmeI पाचन पर linker टैग constructs (पालतू जानवर) की निकासी की अनुमति देते हैं. के रूप में आधा linkers biotinylated कर रहे हैं, इन पीईटी constructs streptavidin चुंबकीय मोतियों का उपयोग कर शुद्ध कर रहे हैं. शुद्ध पशुओं के लिए अगली पीढ़ी के अनुक्रमण एडेप्टर और बातचीत के टुकड़े की एक सूची Illumina जीनोम विश्लेषक के रूप में अगली पीढ़ी sequencers के माध्यम से उत्पन्न ligated कर रहे हैं. मानचित्रण और जैव सूचना विज्ञान विश्लेषण तो चिप समृद्ध साइटों बाध्यकारी और चिप समृद्ध chromatin बातचीत ^{8 को} पहचानने के लिए किया जाता है.

हम एक वीडियो का उत्पादन किया है प्रोटोकॉल Chia पीईटी, विशेष रूप से चिप की तैयारी के महत्वपूर्ण पहलुओं के प्रदर्शन के रूप में चिप के गुणवत्ता एक चिया पीईटी पुस्तकालय के परिणाम में एक प्रमुख भूमिका निभाता है. के रूप में प्रोटोकॉलबहुत लंबे समय से है, केवल महत्वपूर्ण कदम वीडियो में दिखाए जाते हैं.

Protocol

ए Chromatin immunoprecipitation (चिप) (1 चित्र देखें) 1. Chromatin बन्धे प्रोटीन और सेल कटाई की दोहरी Crosslinking (वीडियो का 02:10 पर) Chromatin immunoprecipitation (चिप) Chia-पीईटी एक पुस्तकालय के निर्माण में शामिल पहला महत्वपूर्ण कदम है. यह कदम महत्वपूर्ण है जटिलता, पृष्ठभूमि शोर के स्तर को कम करने के लिए और विशिष्टता जोड़ने. चिप की तैयारी करने के लिए सेल और ब्याज के प्रकार कारक के लिए अनुकूलित किया जा आवश्यकता होगी. इस प्रोटोकॉल शाही सेना पोलीमरेज़ द्वितीय Chia पीईटी MCF-7 9 हमारी प्रयोगशाला में निर्मित कोशिकाओं से तैयार पुस्तकालय पर आधारित है. सुनिश्चित करें कि पर्याप्त जटिलता के परिणामस्वरूप पुस्तकालय है, हम 1 x 10 8 कोशिकाओं का उपयोग करने के लिए चिप सामग्री तैयार करने की सलाह देते हैं. लक्ष्य और सेल लाइन पर निर्भर करता है, प्राप्त उपज 100 एनजी 300 एनजी के बीच हो सकता है. हम अनुशंसा करते हैं कि 100 एनजी चिप की एक न्यूनतम करने के लिए सह करने के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिएअनुक्रमण दौरान अतिरेक कम से कम से कम 20 पीसीआर चक्र के साथ एक पुस्तकालय Chia पीईटी nstruct. चिप सामग्री की उच्च मात्रा के अतिरेक में और कटौती के लिए अनुमति, पुस्तकालयों की गुणवत्ता में सुधार होगा. 1 10 x 8 MCF 7 कोशिकाओं फास्फेट (2 x 10 7 कोशिकाओं के पांच 500 सेमी 2 वर्ग प्लेटों के बराबर) के साथ दो बार धो buffered खारा (पीबीएस) 37 में पूर्व गरम डिग्री सेल्सियस 1.5 मिमी के साथ Crosslink MCF 7 कोशिकाओं हौसले से एक रासायनिक धूआं हुड में रोटेशन के साथ कमरे के तापमान (22 डिग्री सेल्सियस) पर 45 मिनट के लिए तैयार EthylGlycol बीआईएस (SuccinimidylSuccinate) (ईजीएस)). 1% की एक अंतिम एकाग्रता के लिए एक रासायनिक धूआं हुड में रोटेशन के साथ कमरे के तापमान (22 डिग्री सेल्सियस) पर 20 मिनट के लिए 37% formaldehyde जोड़ें. 200 मिमी की एक अंतिम एकाग्रता के लिए 2 एम ग्लाइसिन जोड़कर crosslinkers बुझा लेते हैं. कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए सेते(22 डिग्री सेल्सियस) रोटेशन के साथ. एक अपशिष्ट फ्लास्क में quenched crosslinkers त्यागें और कोशिकाओं ठंड पीबीएस के साथ दो बार धो. Scraping द्वारा PBS और फसल की कोशिकाओं को त्यागें. बर्फ पर काटा कोशिकाओं रखें. 5ml पीबीएस (protease inhibitors ("+ पीआई") के साथ निर्माता के निर्देशों के अनुसार) कोशिकाओं के संग्रह को अधिकतम करने के साथ थाली कुल्ला. गोली 4 में 10 मिनट के लिए 1800 XG (3000 rpm) पर कोशिकाओं ° सी. तैरनेवाला त्यागें और सेल करने के लिए आगे बढ़ना. वैकल्पिक रूप से, -80 में गोली की दुकान ° सी. 2. सेल (वीडियो का 04:15 पर) Resuspend गोली 15 मिलीग्राम pipetting द्वारा अच्छी तरह से 0.1% एसडीएस lysis बफर (50 मिमी pH7.5 HEPES, 150 मिमी NaCl, 1 मिमी EDTA, 1% ट्राइटन X-100, 0.1% सोडियम Deoxycholate, 0.1% एसडीएस पीआई +) में. 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए बारी बारी से X 800 में गोली कोशिकाओं lysed10 मिनट के लिए (2000 rpm) में 4 छ ° सी. तैरनेवाला त्यागें और सेल प्रति एक बार 2.1 और 2.2 कदम के रूप में दोहराना. पृथक परमाणु गोली परमाणु lysis के लिए तैयार है. वैकल्पिक रूप से -80 में, दुकान गोली डिग्री सेल्सियस 3. परमाणु lysis (वीडियो की 05:00 पर) परमाणु lysis Crosslinked chromatin chromatin विखंडन से पहले जारी करने के लिए किया जाता है. परमाणु झिल्ली के अभाव में, Crosslinked chromatin gentler शर्तों का उपयोग sonicated जा सकता है. कभी कभी, sonication ताकत जो मामले में परमाणु झिल्ली तोड़ने के लिए पर्याप्त नहीं हो सकता है, कम chromatin क्योंकि अक्षुण्ण नाभिक centrifugation के बाद खारिज कर दिया जाएगा प्राप्त किया जाएगा. हालांकि, विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं को अलग अलग परिस्थितियों की आवश्यकता हो सकती है. Resuspend पृथक नाभिक गोली मिलीग्राम 15 में 1% एसडीएस lysis बफर (50 मिमी HEPES pH7.5, 150 मिमी NaCl, 1 मिमी EDTA, 1% ट्राइटन X-100, 0.1% सोडियम Deoxycholate, 1% एसडीएस PI +). एक उच्च गति अपकेंद्रित्र ट्यूब (ओक रिज अपकेंद्रित्र ट्यूब (polypropylene)) नाभिक निलंबन स्थानांतरण और 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए बारी बारी से 47,810 XG (20,000 rpm) में 4 डिग्री सेल्सियस पर गोली नाभिक गोली 30 मिनट के लिए lysed पसाना तैरनेवाला और एक P1000 विंदुक टिप के साथ तोड़ गोली. 30 मिलीलीटर 0.1% एसडीएस lysis बफर PI (+) के साथ गोली धो लें. 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए बारी बारी से गोली 47,810 XG (+२०,००० rpm) में 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए chromatin तैरनेवाला त्यागें और दोहराने 3.6-3.4 कदम प्रति के रूप में एक बार chromatin खंडन करने के लिए आगे बढ़ने से पहले धो. वैकल्पिक रूप से, -80 में दुकान chromatin गोली डिग्री सेल्सियस 4. Chromatin के विखंडन (वीडियो का 07:03 पर) स्थानांतरण chromatin एक 14 मिलीलीटर polystyrene दौर नीचे टेस्ट ट्यूब के लिए गोली. Chromatin पे 1 मिलीग्राम 0.1% एसडीएस lysis बफर PI (+) जोड़ेंllet. सुनिश्चित करें कि वहाँ मिश्रण में कोई बुलबुले के रूप में इस sonication क्षमता को प्रभावित करेगा. एक Branson डिजिटल Sonifer सेल disrupter (आयाम 35%, 9 मिनट (30 सेकंड पर, बंद 30 सेकंड)) और सभी समय पर नमूने ठंडा रखने के लिए प्रदर्शन करने से रोकने के overheating के साथ 200 से 600 आधार जोड़े की एक आकार chromatin डीएनए कतरें एक ठंडे कमरे में sonication (चित्रा 2 देखें). Chromatin की एक अशेष भाजक रिवर्स Crosslink और निम्न चरणों के साथ विखंडन दक्षता की जांच (निम्नलिखित कदम वीडियो में नहीं दिखाया गया है). अशेष भाजक sonication के बाद 10 μl chromatin की. अपकेंद्रित्र 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 16,110 XG (13,200 rpm) पर chromatin sonicated एक नया ट्यूब तैरनेवाला स्थानांतरण और proteinase कश्मीर समाधान के 2 μl जोड़ें. 50 पर 30 मिनट के लिए सेते डिग्री सेल्सियस रिवर्स Crosslinked एक 1.5% agarose जेल पर chromatin संकल्प. Repeaटी sonication अगर डीएनए के आकार बड़ा से अधिक की उम्मीद कर रहे हैं. 16,110 XG (13,200 rpm) में 4 पर 30 मिनट के लिए शेष lysate अपकेंद्रित्र ° सी और हस्तांतरण एक नया ट्यूब में चुंबकीय मोतियों के साथ preclearing पहले chromatin (तैरनेवाला) sonicated. वैकल्पिक रूप से, दुकान -80 chromatin sonicated ° C तक पर्याप्त chromatin एक चिप शुरू करने के लिए एकत्र किया जाता है. 5. वॉशिंग Preclearing, और कोटिंग एंटीबॉडी के मनकों (वीडियो का 08:17 पर) Chromatin की Preclearing एक आईपी के लिए चुंबकीय प्रोटीन जी मोतियों की 300 μl का प्रयोग करें. मोती तीन बार धो साथ 5 मिलीलीटर मोती बफर वाश (पीबीएस, 0.1% ट्राइटन X-100). यह और भविष्य washes चुंबकीय प्रोटीन जी मोती शामिल निम्न चरणों का मिलकर बनता है. सुनिश्चित करें चुंबकीय मोतियों बाहर सूखी नहीं. एक चुंबकीय कण concentrator का उपयोग मोती पुनः प्राप्त. डीतैरनेवाला iscard. बफर के साथ मोती Resuspend. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए बारी बारी से 4 में 1 मिनट के लिए 129 XG (800 rpm) पर अपकेंद्रित्र डिग्री सेल्सियस एक चुंबकीय कण concentrator का उपयोग मोती पुनः प्राप्त. तैरनेवाला त्यागें. Prewashed मोतियों के साथ sonicated chromatin गठबंधन, chromatin की माला के लिए बाध्य पृष्ठभूमि निकालें. Sonicated chromatin की 10 μl मात्रात्मक पीसीआर (qPCR) द्वारा आगामी संवर्धन की जांच करने के लिए "इनपुट" के रूप में रखें. 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर 4 में रातोंरात घुमाएँ डिग्री सेल्सियस अपकेंद्रित्र 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 मिनट के लिए 129 XG (800 rpm) पर chromatin sonicated चुंबकीय कण concentrator पर ट्यूब रखें. कोटिंग चुंबकीय मोतियों एंटीबॉडी अशेष भाजक 300 चुंबकीय प्रोटीन जी मोतियों की एक ताजा ट्यूब μl. मोती तीन बार धो 5ml मोती धो बफर (पीबीएस, 0.1% ट्राइटन X-100) के साथ. मोती धो बफर के एक बराबर मात्रा में जोड़ें (5.1.3 कदम के रूप में). शाही सेना पोलीमरेज़ द्वितीय (8WG16) मोनोक्लोनल एंटीबॉडी की 35 ग्राम जोड़ें. 4 में रातोंरात घुमाएँ डिग्री सेल्सियस एंटीबॉडी में लिपटे मोतियों दो बार धो 5 मिलीलीटर मोती धो बफर के साथ. एंटीबॉडी में लिपटे एक चुंबकीय कण concentrator का उपयोग मोती को पुनः प्राप्त. 6. Chromatin immunoprecipitation (10:03 वीडियो की) जटिलता और पृष्ठभूमि शोर के स्तर को कम करने के लिए, विशिष्ट प्रोटीन कारकों के खिलाफ एंटीबॉडी निकटता 6 ligation पहले हित के विशिष्ट chromatin टुकड़े को समृद्ध करने के लिए किया जाता है. यहाँ, हम एक माउस आरएनए पोलीमरेज़ मोनोक्लोनल द्वितीय(8WG16) एंटीबॉडी कि प्रोटीन की दीक्षा फार्म को मान्यता दी. समृद्ध बनाने के डीएनए टुकड़े कि शाही सेना पोलीमरेज़ द्वितीय, पुस्तकालय की विशिष्टता की अनुमति बढ़ाया जा सकता है के साथ जुड़े रहे हैं लंबी दूरी की सक्रिय प्रमोटरों और उनके इसी नियामक 9 क्षेत्रों के बीच chromatin बातचीत की पहचान. एंटीबॉडी में लिपटे मोतियों से एक चुंबकीय कण concentrator की मदद के साथ बफर धो लो त्यागें. स्थानांतरण चुंबकीय कण concentrator के एंटीबॉडी में लिपटे मोती (5.2.7 कदम से) मदद से chromatin (5.1.6 कदम से सतह पर तैरनेवाला) sonicated. 4 में रातोंरात घुमाएँ डिग्री सेल्सियस 7. वॉशिंग और Immunoprecipitated डीएनए प्रोटीन परिसरों के क्षालन (11:13 वीडियो की) तीन बार chromatin – immunoprecipitated मोती को धो 5 मिलीग्राम 0.1% एसडीएस lysis बफर के साथ. मोती एक बार धो 5 मिलीग्राम उच्च नमक धो बफर (50 मिमी HEPES 7.5 पीएच के साथ, 350 मिमी NaCl, 1 मिमी EDTA, 1% Triton एक्स 100-0.1% सोडियम Deoxycholate, 0.1% एसडीएस). मोती एक बार धो 5 मिलीग्राम लिथियम क्लोराइड धो बफर (10 मिमी Tris 8.0 पीएच, 250 मिमी LiCl, 1 मिमी EDTA, 0.5% Nonidet P-40, 0.5% सोडियम Deoxycholate) के साथ. 1 मिलीलीटर ते बफर के साथ बफर और resuspend धोया मोती धो त्यागें. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए बारी बारी से नमूना quantitation और चिप संवर्धन की जांच के लिए तैयार है. एक बार जब पर्याप्त चिप सामग्री एकत्र किया गया है, नमूना Chia-पीईटी एक पुस्तकालय में निर्मित होने के लिए तैयार है. यह कदम महत्वपूर्ण है, और सफल पुस्तकालय Chia पीईटी निर्माण सुनिश्चित करने के लिए किया जाना चाहिए. चिप समृद्ध मोती 4 में 2 सप्ताह के लिए भंडारित किया जा सकता डिग्री सेल्सियस जबकि quantitation, चिप संवर्धन की जाँच, और पर्याप्त सामग्री के संचय के दौर से गुजर. Elute और रिवर्स crosslink "इनपुट" डीएनए और निम्न चरणों के साथ चिप समृद्ध मोती (निम्नलिखित कदम वीडियो में नहीं दिखाया जाता है.) 200 μl चिप क्षालन बफर (50 मिमी Tris 8.0 पीएच, 10 मिमी EDTA, 1% एसडीएस) साथ चिप के समृद्ध मोतियों की 20% Elute. 37 पर 30 मिनट के लिए बारी बारी से ° सी. +६१०० XG (800 rpm) में eluted मोती 4 में 1 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र डिग्री सेल्सियस स्थानांतरण एक नया ट्यूब eluted चिप (तैरनेवाला) चुंबकीय कण concentrator की मदद के साथ परिसरों. रिवर्स crosslink "इनपुट" और 2 घंटे के लिए 2 μl proteinase (0.2 छ / एमएल की अंतिम एकाग्रता) 50 ° कश्मीर सी. के साथ eluted चिप परिसरों स्थानांतरण रिवर्स Crosslinked "इनपुट" डीएनए और 2 मिलीलीटर MaXtract उच्च घनत्व में eluted डीएनए चिप (क्रमशः). एक रासायनिक धूआं हुड में ट्यूब के लिए 200 μl 25:24:1 Phenol क्लोरोफॉर्म – Isoamyl शराब 7.9 पीएच जोड़ें और मिश्रण अच्छी तरह से पलटना. 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर 16,110 XG (13,200 rpm) पर ट्यूबों स्पिन. एक नया ट्यूब स्थानांतरण ऊपरी चरण जलीय पेंदी में बैठ जाना और Crosslinked डीएनए बुद्धि रिवर्सघंटे 20 μl 3 एम सोडियम एसीटेट 5.5 पीएच, 200 μl isopropanol और 1 μl 15 मिलीग्राम / एमएल Glycoblue. -80 डिग्री सेल्सियस में 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट और गोली डीएनए के लिए 16,110 XG (13,200 rpm) पर 30 मिनट के लिए सेते Isopropanol उपजी डीएनए की centrifugation के बाद, 75% इथेनॉल ठंडा के साथ डीएनए गोली दो बार धोने और 20 μl ते बफर में resuspend डीएनए गोली. "इनपुट" (5.1.3 कदम से) और picogreen परख 10 द्वारा डीएनए चिप डीएनए quantitate. गुणात्मक पीसीआर (qPCR) के माध्यम से एक संवर्धन की जांच करने के. बी Chromatin इंटरेक्शन विश्लेषण बनती अंत टैग अनुक्रमण (Chia पीईटी) का उपयोग वीडियो की दूसरी छमाही एक चिया पीईटी पुस्तकालय के निर्माण में महत्वपूर्ण कदम पर प्रकाश डाला जाएगा. 1. चिप डीएनए टुकड़े की समाप्ति blunting वीडियो के इस अध्याय दो मीटर पर प्रकाश डाला गयाऐन अंक, चुंबकीय मोतियों धोने के एंजाइमों को हटाने और पिछले रिएक्शन (1.1 चरण, 12:22 वीडियो की 12:54) और एंजाइमी प्रतिक्रियाओं की स्थापना की प्रक्रिया के नमक buffering के एक कदम दर कदम प्रक्रिया चुंबकीय मोतियों को शामिल में प्रतिक्रिया मिश्रण (1.2 कदम, 12:54 वीडियो की 13:25). चिप समृद्ध मोती एक बार धो ठंडा ते बफर के साथ. यह और भविष्य चुंबकीय मोतियों को शामिल washes निम्न चरणों का मिलकर बनता है. 4 में 1 मिनट के लिए 6100 XG (800 rpm) अपकेंद्रित्र डिग्री सेल्सियस एक चुंबकीय कण concentrator का उपयोग मोती पुनः प्राप्त. तैरनेवाला त्यागें. मोती बफर जोड़ें. बफर के साथ कार्रवाई flicking द्वारा मोती मिलाएं. 4 में 1 मिनट के लिए 6100 XG (800 rpm) अपकेंद्रित्र डिग्री सेल्सियस एक चुंबकीय कण concentrator का उपयोग मोती पुनः प्राप्त. तैरनेवाला त्यागें. Sonicated overha में भरनेngs, 70 μl 10 एक्स टी -4 डीएनए पोलीमरेज़, 7 μl 10 मिमी dNTPs और 615.8 μl nuclease मुक्त पानी के लिए बफर के साथ एक मास्टर मिश्रण तैयार करते हैं. अच्छी तरह मिक्स और मास्टर मिश्रण के साथ धोया मोती resuspend. 7.2 μl 9.7 यू / 700 μl की एक अंतिम मात्रा μl टी -4 डीएनए पोलीमरेज़ जोड़ें. मिश्रण और 37 पर 40 मिनट के लिए सेते हैं ° रोटेशन के साथ सी (खुफिया – मिक्सर Palico बायोटेक RM-2L, F8, rpm 30, 50 = यू, यू = 60 का उपयोग करते हुए). निम्न चरणों के साथ बाद के सभी एंजाइमी प्रतिक्रियाओं प्रदर्शन. Nuclease मुफ्त पानी के साथ प्रतिक्रिया buffers पतला. पतला बफर करने के लिए अन्य सभी अभिकर्मकों (एंजाइमों को छोड़कर) जोड़ें. मिश्रण अच्छी तरह से. प्रतिक्रिया मिश्रण के साथ मोती / गोली Resuspend. Resuspended मोती / गोली (सभी समय पर benchtop कूलर बॉक्स पर एंजाइमों रखें अधिकतम enzymatic गतिविधि को सुनिश्चित करने के लिए) के लिए एंजाइम जोड़ें. Parafilm साथ ट्यूब सील. सुनिश्चित करें कि मोती पूरी incubatio भर में अच्छी तरह से मिश्रित कर रहे हैंn. प्रतिक्रिया मिश्रण त्यागें और दूर ठंडा धोने बफर (10 मिमी Tris Cl 7.5 पीएच, 1 मिमी EDTA, 500 मिमी NaCl) के साथ अवशिष्ट बफर लवण और एंजाइमों धोने तीन बार. 2. Biotinylated आधा Linkers के डीएनए को चिप Ligation वीडियो के इस अध्याय आधा linker oligonucleotides Chia पीईटी के निर्माण में प्रयोग किया जाता है और nucleotide बारकोड संरचना का उपयोग करने के लिए गैर विशिष्ट और विशिष्ट ligation उत्पादों (13:28-14:24) के बीच भेद की विशेषताओं पर प्रकाश डाला गया वीडियो) अध्याय भी एक आधा linker ligation रिएक्शन (2.2 चरण, 14:24 वीडियो की 15:54) की स्थापना के कदम दर कदम प्रक्रिया से पता चलता है. Linkers biotinylated आधे के दो प्रकार इस प्रोटोकॉल में पेश कर रहे हैं और एक आंतरिक चार nucleotides (TAAG या ATGT) के बारकोड और प्रकार IIS प्रतिबंध एंजाइम MmeI (TCCAAC) के लिए एक मान्यता साइट के साथ डिजाइन किए हैं. बाद चिप को समृद्धजाहिर sonicated, chromatin टुकड़े समान रूप से दो aliquots में विभाजित कर रहे हैं और पहले भी आधा linker एक या आधा linker 5,9 बी के एक अतिरिक्त के साथ ligated. दो biotinylated एक या आधा linkers बी क्रमशः आधा linkers द्वारा डीएनए आधा linker ligation के लिए aliquots में चिप समृद्ध मोती फूट डालो. Nucleotide बारकोड के रूप में, इन दो आधे linkers ही nucleotide दृश्यों में सेवा करते हैं जो मध्यम (आधा linker ATGT साथ बी TAAG आधा linker के साथ एक) में चार nucleotides को छोड़कर है. जब निकटता ligation, दो अलग चिप परिसरों के बीच यादृच्छिक और गैर विशिष्ट ligations के दौरान संयुक्त heterodimer एबी linkers साथ दृश्यों की आबादी से पहचाना जा सकता है, के रूप में विशिष्ट ligations जो homodimer ए.ए. या बी बी linkers साथ दृश्यों की आबादी से पहचाना जा सकता है के साथ तुलना में . 140 μl 5 एक्स खूंटी के साथ टी -4 डीएनए ligase बफर के साथ कटी घमनी को बांधना चिप समृद्ध मोती, 3.5 μl 200 एनजी / μl biotinylated आधा linkers ए या बी, 553.5 μl nucleaseमुफ्त पानी और 3 μl 30 यू / μl टी -4 डीएनए ligase (हर समय एक benchtop कूलर बॉक्स पर टी -4 डीएनए ligase रखें रूप ligases बर्फ पर भी अस्थिर हैं). Parafilm साथ ट्यूब सील और 16 पर रातोंरात सेते हैं ° रोटेशन के साथ सी. 3. क्षालन और चिप डीएनए टुकड़े की निकटता Ligation वीडियो के इस अध्याय मोतियों से chromatin परिसरों के क्षालन दौरान बफर EB, एसडीएस और ट्राइटन X-100 की भूमिका बताते हैं और यह भी एक circularization प्रतिक्रिया (3.9 चरण, 15:54 की स्थापना के कदम दर कदम प्रक्रिया से पता चलता है 17:10 वीडियो की). Chromatin टुकड़े को आधा linkers ligating के बाद, दोनों fractions संयुक्त रहे हैं और बंद मोती eluted. इंटरेक्ट करने डीएनए टुकड़े तो निकटता ligation के दौरान एक पूरी linker अनुक्रम से जुड़ा हो. Nucleotide बारकोड संरचना का उपयोग, दृश्यों को तीन श्रेणियों में वर्गीकृत किया जा सकता है, अर्थात् वाई दृश्योंवें heterodimer एबी linkers (बारकोड ATGT / TAAG) और homodimer ए.ए. या बी बी (बारकोड TAAG / TAAG या / ATGT ATGT) linkers गैर विशिष्ट और विशिष्ट ligation उत्पादों 9 क्रमशः भेद साथ दृश्यों. इसलिए, अलग nucleotide बारकोड के साथ दो linkers 1/2-उपयोग विभिन्न प्रयोगों के विनिर्देशन की अनुमति देता है या replicates, के रूप में ही गैर विशिष्ट अलग चिप 5 परिसरों के बीच chimeric ligation दर की निगरानी करने के लिए अच्छी तरह से. आधा linker ligated मोती तीन बार धो ठंडा धो बफर (10 मिमी Tris Cl 7.5 पीएच, 1 मिमी EDTA, 500 मिमी NaCl) के साथ. निम्नलिखित तरीके से आधा linker ligated मोती के दोनों ट्यूबों का मिश्रण. आधा linker-ligated एक चुंबकीय कण concentrator का उपयोग कर मोतियों की ट्यूब ("ट्यूब") में से एक को पुनः प्राप्त. बर्फ पर आधा linker-ligated मोती (ट्यूब "बी") के अन्य ट्यूब रखें. बफर वाश (3.2.1 कदम से) च त्यागेंरॉम ट्यूब और ट्यूब बी से एक ट्यूब में आधा linker-ligated मोती (3.2.2 कदम से) हस्तांतरण ट्यूब, जबकि एक चुंबकीय कण कलेक्टर पर अब भी है. ट्यूब बी 700 μl धो ठंडा बफर जोड़ने के लिए किसी भी अवशिष्ट आधे linker-ligated मोती को इकट्ठा करने और यह सुनिश्चित आधे linker ligated मोती के दोनों ट्यूबों ठीक से संयुक्त कर रहे हैं. ट्यूब ए में स्थानांतरण धोने बफर खाली ट्यूब बी त्यागें 70 μl 10 एक्स टी -4 डीएनए ligase (चंचु) बफर, 616 μl nuclease मुक्त पानी और 14 μl 10 यू / टी -4 डीएनए polynucleotide Kinase की μl साथ phosphorylate आधा linker-ligated मनकों. रोटेशन के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर 50 मिनट के लिए सेते हैं. Phosphorylated आधा linker-ligated एक चुंबकीय कण concentrator का उपयोग मोती को पुनः प्राप्त और प्रतिक्रिया मिश्रण त्यागें. 200 μl हौसले से तैयार क्षालन बफर (ते बफर, 1% एसडीएस) के साथ आधा linker ligated जटिल chromatin डीएनए Elute. कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए सेते (22 °सी) रोटेशन के साथ. एक ताजा ट्यूब प्रोद्धावन में प्रयोग किया जाने वाला घोलक स्थानांतरण लिए और 900 μl बफर EB साथ मोती कुल्ला. एक ही ट्यूब तैरनेवाला स्थानांतरण करने के लिए elutions गठबंधन. दो अपकेंद्रित्र ट्यूब फिल्टर और कमरे के तापमान पर 1 मिनट (22 डिग्री सेल्सियस) के लिए सेन्ट्रीफ्यूज +१६११० XG (+१३,२०० rpm) के फिल्टर कप के लिए एकत्र प्रोद्धावन में प्रयोग किया जाने वाला घोलक स्थानांतरण. 90 μl 20% X-100 ट्राइटन जोड़कर एसडीएस पृथक और मिश्रण अच्छी तरह से पलटना. 37 में 1 घंटे के लिए सेते डिग्री सेल्सियस Circularization बेहद पतला शर्तों के तहत किया जाता है क्रम में व्यक्तिगत पार से जुड़े परिसरों के भीतर chromatin ligation घटनाओं के पक्ष में जबकि विभिन्न chromatin परिसरों जो अवांछनीय chimeric डीएनए अणु को जन्म देना होगा बीच ligation घटनाओं को कम करने के लिए. बर्फ पर कार्य करना, एक 50 मिलीलीटर बाज़ ट्यूब quenched प्रोद्धावन में प्रयोग किया जाने वाला घोलक हस्तांतरण और 7776 μl nuclease मुक्त पानी, 1000 μl 10 एक्स टी -4 डीएनए ligase बफर (चंचु) और 33.33 μl 30 यू / μl टी -4 डीएनए ligase जोड़ें. 16 पर रातोंरात सेतेडिग्री सेल्सियस 4. रिवर्स Crosslinking और शोधन डीएनए क्लोरोफॉर्म (4.3 कदम, 17:11-17:59) 4.4 चरण में centrifugation के बाद pelleted डीएनए के निष्कर्षण और करीब: वीडियो के इस अध्याय phenol के कदम दर कदम प्रक्रिया से पता चलता है. रिवर्स crosslink और 100 μl 20 मिलीग्राम / एमएल proteinase कश्मीर समाधान जोड़कर नीचा प्रोटीन. 50 डिग्री सेल्सियस से कम 2 घंटे के लिए सेते एक 50 मिलीलीटर MaXtract उच्च घनत्व में chromatin डीएनए स्थानांतरण और 9ml nuclease मुक्त पानी जोड़ने के लिए 19 मिलीलीटर की एक अंतिम मात्रा प्राप्त. एक रासायनिक धूआं हुड में ट्यूब के लिए 19 मिलीलीटर 25:24:1 Phenol क्लोरोफॉर्म – Isoamyl शराब 7.9 पीएच जोड़ें और मिश्रण अच्छी तरह से पलटना. (3,000 rpm) कमरे के तापमान पर 1,800 XG में 5 मिनट के लिए ट्यूबों स्पिन. 50 मिलीलीटर ओक रिज अपकेंद्रित्र (Teflon FEP) ट्यूब और तलछट chromatin डीएनए 1.9 मिलीलीटर 3 एम सोडियम एसीटेट 5.5 पीएच, 19 मिलीलीटर isopropan के साथ ऊपरी चरण जलीय स्थानांतरणराजभाषा और 5 μl Glycoblue. Glycoblue गोली की दृश्यता को बढ़ाने के लिए जोड़ा गया है. -80 डिग्री सेल्सियस पर कम से कम एक घंटे के लिए सेते हैं. 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए 38,720 XG (18,000 rpm) पर centrifuging से पहले पिघलना जमे हुए समाधान की अनुमति Centrifugation isopropanol उपजी डीएनए के बाद, 75% इथेनॉल ठंडा के साथ डीएनए गोली दो बार धोने और 34 μl बफर EB में resuspend डीएनए गोली. एक 1.7 मिलीलीटर की डीएनए LoBind ट्यूब स्थानांतरण करने के लिए डीएनए मिश्रण. 34 μl बफर EB में Resuspend डीएनए गोली. (RNase उपचार वैकल्पिक बाद धोने और Chia पीईटी प्रोटोकॉल में शोधन कदम के रूप में contaminating शाही सेना और हमारे घर में पुस्तकालयों से Chia पीईटी दृश्यों के मैनुअल निरीक्षण प्रदर्शित किया है आरएनए contaminating का कोई निशान हटाने की सेवा). 10 μl RNase एक 10 x रिएक्शन बफर, 55 μl nuclease मुक्त पानी और 1 μl 10 यू / μl RNase Ribonuclease जोड़कर RNase पाचन प्रदर्शन. 37 पर सेते° सी एक घंटे के लिए. 2 मिलीलीटर MaXtract उच्च घनत्व में chromatin डीएनए स्थानांतरण. एक रासायनिक धूआं हुड में ट्यूब के लिए 100 μl 25:24:1 Phenol क्लोरोफॉर्म – Isoamyl शराब 7.9 पीएच जोड़ें और मिश्रण अच्छी तरह से पलटना. 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान (22 डिग्री सेल्सियस) पर 16,110 XG (13,200 rpm) पर ट्यूब स्पिन. एक नया ट्यूब और तलछट रिवर्स Crosslinked 10 μl एम 3 सोडियम एसीटेट 5.5 पीएच और 100 μl isopropanol के साथ डीएनए ऊपरी चरण जलीय स्थानांतरण. -80 डिग्री सेल्सियस में 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट और गोली डीएनए के लिए 16,110 XG (13,200 rpm) पर 30 मिनट के लिए सेते Centrifugation isopropanol उपजी डीएनए के बाद, 75% इथेनॉल ठंडा के साथ डीएनए गोली दो बार धोने और 34 μl बफर EB में resuspend डीएनए गोली. 5. Chia पीईटी डीएनए की streptavidin मोती को स्थिरीकरण उपस्थिति के बारे में इस अध्याय वार्ता की शुरूआतमान्यता MmeI साइट और biotinylated आधा linker oligonucleotides में मौजूद टैग linker टैग constructs ("जाते", 18:02 वीडियो की 19:10) की निकासी की सुविधा टी के. इसके अलावा, वीडियो के इस अध्याय में भी 5.2 कदम, एक पीसीआर प्रतिक्रिया (6.1 चरण, 19:10 वीडियो की 20:00) की स्थापना और एक सफल excising कदम दर कदम प्रक्रिया की एक त्वरित समग्र दृष्टिकोण देता है Chia पीईटी डीएनए (6.9 चरण, 20:00 20:30). आधा linkers ए और बी MmeI मान्यता साइटों flanking, इस प्रकार IIS प्रतिबंध एंजाइम में कटौती करने के लिए 18/20 आधार जोड़े अपने लक्ष्य बाध्यकारी साइटों के बहाव chromatin टुकड़ा की कमी "टैग" उत्पन्न बनती टैग linker टैग constructs उत्पादन की अनुमति शामिल ("जाते"). Streptavidin लेपित चुंबकीय मोती, दोनों आधा linker ए और बी बायोटिन के साथ संशोधित कर रहे हैं द्वारा पीईटी constructs की शुद्धि को सक्षम करने के लिए, पर कब्जा और Chia पीईटी constructs के शुद्धि की अनुमति. रिलीज ग5 10 μl जोड़कर aptured Chia पीईटी डीएनए x 4 NEBuffer, 5 μl हौसले से 500 (10 x) सुक्ष्ममापी (एसएएम) एस adenosylmethionine और 1 μl 2 / resuspended डीएनए को μl MmeI यू के लिए तैयार है. प्रतिक्रिया के लिए मिश्रण MmeI 5 μl गैर biotinylated आधा linkers जोड़कर अतिरिक्त MmeI बुझाने के आत्म – निरोधात्मक अधिक हो सकता है. 37 में 2 घंटे के लिए सेते डिग्री सेल्सियस करने के लिए एक डीएनए LoBind ट्यूब के लिए जारी Chia पीईटी डीएनए, resuspended M-280 streptavidin मोती के हस्तांतरण 50μl कब्जा. मोती दो बार धो 2 एक्स बाध्यकारी और बफर धुलाई (2 एक्स बी एंड डब्ल्यू: 10 मिमी Tris – एचसीएल 7.5 पीएच, 1 मिमी EDTA, एम 2 NaCl) के साथ. 50 μl 2 बफर x B & W में Resuspend मोती और पाचन मिश्रण के 50 μl (5.1 कदम से) एक ही ट्यूब को हस्तांतरण. अच्छी तरह मिक्स और रोटेशन के साथ कमरे के तापमान पर 45 मिनट के लिए सेते हैं. एक चुंबकीय कण concentrator का उपयोग मोती कृषि योग्य बनाना और सतह पर तैरनेवाला त्यागें. मोती दो बार धो 150 μl 1 x बाध्यकारी और वॉशिंग बफर (1 x बी और डब्ल्यू: 5 मिमी Tris – एचसीएल 7.5 पीएच, 0.5 मिमी EDTA, 1 एम NaCl) के साथ. <li> 5 μl 10 एक्स टी -4 डीएनए ligase बफर (ध्यान दें कि इस चरण में इस्तेमाल किया ligase बफर 3.9 कदम से अलग है के साथ कटी घमनी को बांधना GS20 454 Chia पीईटी डीएनए Adaptors, ligase बफर इस चरण में इस्तेमाल किया जो कि के रूप में एक ही कंपनी की ओर से एक से है टी -4 डीएनए ligase), 4 μl 200 एनजी / μl 454 GS20 अडैप्टर, 4 μl 200 एनजी / μl 454 GS20 अडैप्टर बी, 36 μl nuclease मुक्त पानी और 1 μl 30 यू / μl टी -4 डीएनए ligase की आपूर्ति. रोटेशन के साथ 16 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात सेते हैं. Chia पीईटी डीएनए भी Illumina-एनएन एडेप्टर साथ ligated किया जा सकता है, जो मामले में हम प्राइमर पीसीआर PE1.0 और प्राइमर पीसीआर पीई 2.0 Illumina से खरीदा पुस्तकालय के प्रवर्धन की सलाह देते हैं. एक चुंबकीय कण concentrator का उपयोग मोती कृषि योग्य बनाना और सतह पर तैरनेवाला त्यागें. धो 150 1 μl बफर एक्स बी और डब्ल्यू के साथ मोती तीन बार. 5 10 μl के साथ निक अनुवाद डीएनए Chia पीईटी x 2 NEBuffer, 2.5 μl 10 मिमी dNTPs, 38.5 μl nuclease मुक्त पानी और 4 μl 10 यू / μl Escherichia कोलाई डीएनए पोलीमरेज़ मैं रातोंरात सेतेरोटेशन के साथ कमरे के तापमान (22 डिग्री सेल्सियस). एक चुंबकीय कण concentrator का उपयोग मोती कृषि योग्य बनाना और सतह पर तैरनेवाला त्यागें. धो 150 1 μl बफर एक्स बी और डब्ल्यू के साथ मोती तीन बार. 50 μl बफर EB के साथ मोती Resuspend. 6. Chia पीईटी डीएनए के प्रवर्धन पीसीआर प्रतिक्रियाओं 2 μl मोती निलंबन के साथ, 21 μl nuclease मुफ्त पानी, 1 μl 10 सुक्ष्ममापी Illumina 1-454 प्राइमर, 1 μl सुक्ष्ममापी 10 Illumina 2-454 प्राइमर और 25 μl Phusion उच्च फिडेलिटी मास्टर मिक्स सेट. अनुक्रमण के लिए पर्याप्त पीसीआर उत्पादों उत्पन्न करने के लिए आवश्यक चक्र की संख्या का निर्धारण करने के लिए, 18 16, और 20 चक्र के साथ तीन परीक्षण पीसीआर प्रतिक्रियाओं सेट. से अधिक के रूप में हमने पाया है कि बहुत कम पुस्तकालय जटिलता में तो परिणाम कर 20 चक्र. प्रारंभिक कदम 30 सेकंड 98 डिग्री सेल्सियस (विकृतीकरण) 18 से 25 चक्र 10 सेकंड 98 डिग्री सेल्सियस (विकृतीकरण) 30 सेकंड 65 डिग्री सेल्सियस (Annealing) 30 सेकंड 72 डिग्री सेल्सियस (विस्तार) अंतिम चरण 5 मिनट 72 डिग्री सेल्सियस (अंतिम विस्तार) एक 4-20% ढाल tbe और SYBR मैं ग्रीन के साथ जेल धुंधला हो पर पीसीआर प्रतिक्रियाओं चल रहे हैं, 223 आधार जोड़े, जो Chia पीईटी डीएनए की लंबाई है की एक बैंड की उपस्थिति सुनिश्चित करने के कम से कम संभव चक्र संख्या का निर्धारण करते हैं. संभव के रूप में कुछ पीसीआर चक्र के रूप में साथ Chia पीईटी डीएनए वाली एक बड़े पैमाने पर पीसीआर में streptavidin मनकों के बाकी बढ़ाना जबकि अभी भी अनुक्रमण करने के लिए पर्याप्त उपज प्राप्त करने के. फिर सेसभी पीसीआर एक चुंबकीय कण concentrator और दो ताजा डीएनए LoBind ट्यूबों तैरनेवाला पूल का उपयोग प्रतिक्रियाओं से दावा मोती. तैरनेवाला के 60 μl एम 3 सोडियम एसीटेट, 2 μl GlycoBlue और 600 जमा प्रतिक्रियाओं को isopropanol μl जोड़कर प्रत्येक ट्यूब तलछट. -80 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए सेते हैं. 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए 16,110 XG (13,200 rpm) अपकेंद्रित्र 75% ठंडा 100 μl ते बफर और 5 μl 6 एक्स loading डाई में दो बार और इथेनॉल resuspend डीएनए गोली के साथ isopropanol उपजी डीएनए, वॉश डीएनए गोली centrifugation के बाद. पीसीआर उत्पादों से एक 6% tbe जेल के कुओं में समान रूप से वितरित करें. 1 x tbe बफर में 35 मिनट के लिए 200 वी पर जेल और भागो SYBR ग्रीन I. एक अंधेरे रीडर Transilluminator के साथ जेल की कल्पना के साथ दाग. ध्यान आबकारी 223 जेल से बीपी बैंड और "जेल" को कुचलने के रूप में निम्नानुसार डीएनए निष्कर्षण प्रोटोकॉल प्रदर्शन: 0.6 मिलीलीटर microc में excised जेल टुकड़े प्लेसट्यूब है कि एक सुई 21-G के साथ किया गया है तल पर छेदा entrifuge. 4 डिग्री सेल्सियस 5 मिनट के लिए एक 1.5 मिलीलीटर पेंच टोपी और 16,110 XG (13,200 rpm) में ट्यूब अपकेंद्रित्र अंदर प्रत्येक ट्यूब प्लेस प्रत्येक ट्यूब के लिए 200 μl ते बफर 8.0 पीएच जोड़ें और यह सुनिश्चित करें जेल टुकड़े पूरी तरह से बफर में डूब रहे हैं. -80 डिग्री सेल्सियस पर एक घंटे 37 ° रातोंरात सी सेते के लिए रुक. जेल के टुकड़े को एक साथ एक ट्यूब में बफर के साथ स्थानांतरण 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए एक अपकेंद्रित्र ट्यूब और 16,110 XG (13,200 rpm) पर फिल्टर अपकेंद्रित्र के फिल्टर कप 200 μl ते बफर 8.0 पीएच और हस्तांतरण rinsing पहले स्पिन के पूरा होने पर प्रत्येक फिल्टर यूनिट के लिए बफर के साथ प्रत्येक 1.5 मिलीलीटर ट्यूब कुल्ला. फिल्टर के माध्यम से और isopropanol साथ तलछट पूल. Resuspend डीएनए गोली 15 μl ते बफर के साथ. 7. गुणवत्ता की जाँच करेंChia पीईटी डीएनए की घ प्रवर्धन Agilent डीएनए 1000 परख या Agilent Agilent Bioanalyzer 2100 पर उच्च संवेदनशीलता डीएनए परख का उपयोग कर गुणवत्ता की जांच के साथ आगे बढ़ें. Agilent डीएनए परख की electropherogram एक फ्लैट आधार रेखा के साथ साथ Illumina जीनोम विश्लेषक IIx अनुक्रमण करने के लिए आगे बढ़ने से पहले केवल एक चोटी प्रदर्शित करना चाहिए. Illumina जीनोम विश्लेषक IIx अनुक्रमण से पहले, चिया पीईटी डीएनए आदर्श एनएम 10 की एक न्यूनतम एकाग्रता होनी चाहिए. Illumina qPCR मात्रा प्रोटोकॉल गाइड के अनुसार प्रदर्शन करने के लिए एक चार सूत्री मात्रात्मक पीसीआर नमूना प्रवाह सेल पर लोड करने के लिए की राशि निर्धारित है. वैकल्पिक रूप से, के रूप में एक एक बिंदु मात्रात्मक पीसीआर प्रदर्शन: 100 बजे, 10 बजे और 1 बजे नियंत्रण टेम्पलेट पतला. रूप में Illumina qPCR मात्रा प्रोटोकॉल में वर्णित है, एक नियंत्रण टेम्पलेट Illumina मंच पर अनुक्रमण के लिए तैयार किसी भी पुस्तकालय के रूप में परिभाषित किया गया है और यह रूप संभव के रूप में इसी तरह के मामले में होना चाहिएटेम्पलेट आकार, जीसी सामग्री और पुस्तकालय प्रकार. Chia पीईटी डीएनए 10 बजे तक पतला. सेट अप पीसीआर 0.1 μl qPCR 1.1 प्राइमर, 0.1 μl qPCR 2.1 प्राइमर, 5 μl डीएनए LightCycler480 SYBR ग्रीन मैं मास्टर मिक्स, 3.8 μl पानी nuclease मुक्त Roche एप्लाइड साइंस 480 रियल टाइम LightCycler के साथ और टेम्पलेट के 1 μl के साथ प्रत्येक कमजोर पड़ने के triplicates पीसीआर सिस्टम. दो नकारात्मक टेम्पलेट के रूप में nuclease मुक्त पानी की 1 μl का उपयोग नियंत्रण शामिल है. प्रारंभिक विकृतीकरण 95 ° C 5 मिनट 4.8 ° सी / एस प्रवर्धन 95 ° 10 सी 4.8 सेकंड डिग्री सेल्सियस / s 60 ° 1 सी 2.5 मिनट डिग्री सेल्सियस / s 72 ° C 30 4.8 दुरुपयोग की डिग्री सेल्सियस/ S पिघलने वक्र 5 ° सी 95 4.8 दुरुपयोग की डिग्री सेल्सियस / s 65 ° 1 सी 2.5 मिनट डिग्री सेल्सियस / s 95 डिग्री सेल्सियस डिग्री सेल्सियस प्रति 5 अधिग्रहण शीतलन 40 डिग्री सेल्सियस के 10 सेकंड के 2.0 डिग्री सेल्सियस / s यह सुनिश्चित करें कि नकारात्मक नियंत्रण नहीं प्रवर्धन दिखाने के लिए और है कि सीटी मूल्यों के लिए मानक विचलन 0.1 पुस्तकालय मानक नियंत्रण टेम्पलेट dilutions से उत्पन्न वक्र पर आधारित टेम्पलेट्स की एकाग्रता की गणना से पहले की तुलना में कम है. 13:05 int लोड द्वारा Illumina प्रवाह कोशिकाओं की सतह पर उत्पन्न समूहोंओ Illumina CBOT क्लस्टर जनरेशन सिस्टम परदे पर निर्देशों के अनुसार. अनुक्रम Illumina जीनोम विश्लेषक IIx पर डीएनए Chia पीईटी एक सिंगल लेन में Illumina 3-454 अनुक्रमण प्राइमर और Illumina 4-454 अनुक्रमण प्राइमर का उपयोग करने के लिए पुस्तकालय की गुणवत्ता को देखने के लिए आगे बढ़ें. -20 डिग्री सेल्सियस पर शेष डीएनए Chia पीईटी स्टोर यदि लायब्रेरी अच्छा डेटा है, 4 के रूप में 8 नमूना लेन परिणामों पर आधारित की जरूरत के लिए 18 से 20 लाख अद्वितीय पुस्तकें प्राप्त करने के लिए गलियों की अतिरिक्त रन के लिए नमूना तैयार करते हैं. Chia पीईटी डीएनए की मात्रा प्रवाह कोशिकाओं पर लोड के अनुक्रमण डेटा विश्लेषण सॉफ्टवेयर, Illumina अनुक्रमण नियंत्रण स्टूडियो के संस्करण पर काफी निर्भर करता है. 2.9 संस्करण के लिए लोड हो रहा है एक – तिहाई से प्रत्येक टाइल, जो लगभग 21 लाख फ़िल्टर्ड पास equates की अधिकतम क्षमता के आधे एकाग्रता पर्वतमाला के बारे में 9.5 लाख से पालतू जानवरों के पढ़ता के साथ पढ़ता है. कम लोड हो रहा है सही आधार बुला च सुनिश्चित करने के लिए आवश्यक हैया linkers के बारकोड दृश्यों. यह त्रुटि तब होती है जब समान nucleotides के एक उच्च संख्या अनुक्रम कर रहे हैं, के रूप में मामला है अगर linker अनुक्रम है, बारकोडिंग जानकारी प्राप्त करने के. यदि बारकोडिंग जानकारी वांछित नहीं है और linkers पढ़ा नहीं है, तब पूर्ण loading एकाग्रता इस्तेमाल किया जा सकता है. Chia-पीईटी उपकरण स्थापना (4.1 संस्करण) पुस्तिका 8 के अनुसार qSeq ऑफ़लाइन आधार कॉलर द्वारा परिवर्तित फ़ाइलों आगे Chia-पीईटी उपकरण का विश्लेषण का उपयोग कर सकते हैं. प्रतिनिधि सी. Chia पीईटी परिणाम हम सफलतापूर्वक Chia पीईटी MCF 7 कोशिकाओं (CHM160 और CHM163) 9 में शाही सेना पोलीमरेज़ द्वितीय एंटीबॉडी (8WG16) का उपयोग कर चिप सामग्री के 672 एनजी का उपयोग कर के रूप में ऊपर वर्णित पुस्तकालयों का निर्माण किया गया है. प्रारंभिक निदान जेल इस पुस्तकालय पीसीआर प्रवर्धित के चलाने के लिए, के रूप में Chia पीईटी प्रोटोकॉल के 6.2 चरण में उल्लेख किया है, पर एक उज्ज्वल है और अच्छी तरह से परिभाषित बैंड प्रदर्शितसभी पीसीआर साइकिल चालन के लिए प्रयोग किया जाता है (चित्र देखें 4) 223 आधार जोड़े की उम्मीद आकार. 16 पीसीआर चक्र पुस्तकालय Chia पीईटी बढ़ाना करने के लिए इस्तेमाल किया गया था और 17.1 एनजी की कुल उपज प्राप्त हुई थी. एक एकल, तीव्र electropherogram शिखर Agilent डीएनए 1000 विश्लेषण के माध्यम से 223 आधार जोड़े की उम्मीद आकार में Chia पीईटी प्रोटोकॉल (चित्रा 5 देखें) के 7.1 चरण में वर्णित के रूप में मनाया गया. चित्रा 1. चिप सिंहावलोकन. MCF 7 कोशिकाओं के साथ EthylGlycol बीआईएस (SuccinimidylSuccinate (ईजीएस) और formaldehyde sequentially, spatially आसन्न chromatin के बीच सहसंयोजक लिंक में जिसके परिणामस्वरूप पार से जुड़े दोहरी पार से जुड़े chromatin निश्चित MCF-7 कोशिकाओं से सेल द्वारा प्राप्त किया गया था. और परमाणु lysis. chromatin तो 200-600 आधार जोड़े की एक आकार सीमा विखंडन के अधीन protei साथ sonicated chromatin के बाद पूर्व समाशोधन.n जी चुंबकीय गैर विशिष्ट डीएनए निकालने मोती, chromatin पूर्व मंजूरी दे दी है एंटीबॉडी में लिपटे मोतियों के साथ रातोंरात immunoprecipitated ब्याज की chromatin पर कब्जा करने के लिए किया गया था. चित्रा 2. Sonicated chromatin टुकड़े की जेल विश्लेषण एक 100 बीपी डीएनए सीढ़ी आकार के संदर्भ के लिए पहली और आखिरी लेन में दिखाया गया है. sonicated chromatin प्रदर्शित 200 से 600 बीपी के बीच मजबूत तीव्रता जो लंबी दूरी chromatin बातचीत पर कब्जा करने के लिए आदर्श है. चित्रा 3. Chia पीईटी सिंहावलोकन खंडित chromatin टुकड़े अंत पा और biotinylated flanking MmeI प्रतिबंध साइटों युक्त आधा linkers ligated हैं. बरकरार chromatin परिसरों तो मोती बंद eluted और निकटता ligation अधीन बेहद पतला शर्तों के तहत, जैसे कि बातचीत डीएनए टुकड़े preferentially एक दूसरे से ligated. रिवर्स के बाद डीएनए से जुड़े प्रोटीन को हटाने के पार से जोड़ने, MmeI पाचन टैग linker टैग (पीईटी) constructs, जो तब streptavidin मोतियों को चयनात्मक बंधन से शुद्ध कर रहे हैं जारी किया जाता है. पीईटी constructs उच्च throughput अनुक्रमण के लिए एडाप्टर के साथ ligated कर रहे हैं. चित्रा 4. चिया पालतू जानवरों की पीसीआर प्रवर्धन के बाद जेल विश्लेषण एक 25 बीपी डीएनए सीढ़ी लेन 1 और 5 में आकार के संदर्भ के लिए दिखाया गया है. 2 से 4 लेन पीसीआर 16 के बाद उत्पन्न उत्पादों, 18 और मनका immobilized टेम्पलेट के 2 μl, क्रमशः से पीसीआर प्रवर्धन के 20 चक्रों हैं. यह एक सफल पुस्तकालय है, के रूप में उज्ज्वल, 223 बीपी की उम्मीद आकार में अच्छी तरह से परिभाषित बैंड द्वारा संकेत है. धब्बा गैर विशिष्ट जब पीसीआर के चक्र का संख्या बढ़ जाती है, जबकि प्रत्येक पीसीआर प्रतिक्रिया के निम्नतम बैंड प्राइमर dimers से बना है उत्पन्न होता है. <img src= "Alt" > चित्रा 5. Agilent 2100 Agilent 2100 Bioanalyzer 223 बीपी की उम्मीद आकार में एक एकल तीव्र चोटी के साथ एक सफल पुस्तकालय, रूपरेखा electropherograms Illumina-454 अनुकूलक ligated चिया जाते. स्क्रीन पर कब्जा शुद्ध Bioanalyzer विश्लेषण. ध्यान दें कि Agilent Bioanalyzer परख आमतौर पर एक से थोड़ा अधिक से अधिक की उम्मीद आकार की रिपोर्ट है, इस मामले में, शिखर वांछित 223 बीपी की बजाय 237 बीपी पर प्रदर्शित होता है. यह 10% Agilent परख की त्रुटि सीमा के भीतर है.

Discussion

Chia पीईटी प्रतिलेखन विनियमन में लंबी दूरी की बातचीत की पहचान विधि विकसित की है. महत्वपूर्ण कारकों में से एक है है है कि एक चिया पीईटी पुस्तकालय की गुणवत्ता निर्धारित चिप सामग्री की गुणवत्ता है.

वीडियो में दिखाया गया प्रोटोकॉल ईजीएस और formaldehyde के उपयोग कोशिकाओं पार से लिंक शामिल हैं. formaldehyde के उपयोग एक दूसरे पार से जोड़ने की एक लंबे समय तक असर स्पेसर हाथ अभिकर्मक के साथ संयुक्त प्रोटीन है जो formaldehyde द्वारा ^3,11,15 अकेले बाध्य नहीं जा सकता है के बंधन में मदद मिल सकती है. हम इस पद्धति है जो मजबूत बाध्यकारी साइटों और लंबी दूरी की बातचीत ⁹ प्रदर्शन किया है के साथ पुस्तकालयों का निर्माण किया है. हालांकि, पार से जोड़ने और चिप शर्तों हित के हर पहलू के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए, और यह अधिक नहीं crosslink के लिए महत्वपूर्ण है के रूप में बहुत ज्यादा पार से जोड़ने विखंडन में sonication द्वारा कठिनाइयों में परिणाम होगा, और संभवतः नकली chromatin बातचीत में परिणाम हो सकता है . Chromatin बातचीतChia पीईटी प्रतिदीप्ति में स्वस्थानी संकरण ⁴ के रूप में एक अलग तरीका है, के द्वारा की पहचान के द्वारा मान्य किया जाना चाहिए.

हम chromatin सामग्री के 100 एनजी की एक न्यूनतम की सलाह देते हैं. जबकि हम chromatin सामग्री के 50 एनजी से अच्छी गुणवत्ता पुस्तकालयों का निर्माण किया है, हमने देखा है कि प्रारंभिक सामग्री की बड़ी मात्रा की अनुमति कम से कम 16 पीसीआर चक्र, जिससे कम से कम amplicons और प्रत्येक पुस्तकालय के अतिरेक के साथ Chia पीईटी पुस्तकालयों के निर्माण. यह कम अतिरेक उच्च अद्वितीय प्रतिचित्रित और भी उपयोगी डेटा के एक उच्च प्रतिशत टैग के साथ सहसंबद्ध, जिससे अनुक्रमण की कम गलियों के साथ एक अधिक व्यापक chromatin बातचीत नक्शा सक्षम. मोतियों की एक ट्यूब में अंतिम पैक मात्रा 50 μl और चुंबकीय और Sepharose मोतियों के लिए क्रमश: 100 μl होना चाहिए. यदि पैक मनका मात्रा कम से कम कहा गया है, इसी तरह पूर्व मंजूरी दे दी रिक्त चुंबकीय या Sepharose मोतियों के साथ न्यूनतम पैक मात्रा लाने के लिए डीएनए असर मनका के नुकसान को कम करनेबाद के चरणों में है. Sawed बंद सुझावों या बड़े कोर युक्तियाँ Sepharose मोती pipetting के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए.

संशोधनों के बाद पहले प्रकाशित Chia पीईटी ⁵ प्रोटोकॉल के बाद शामिल किया गया. सबसे पहले, चुंबकीय जी मोती washes दौरान नमूना नुकसान को कम करने के लिए इस्तेमाल किया गया. इसके अतिरिक्त, हम 100 बीपी और 138 बीपी की अनुमानित आकार के साथ गैर विशिष्ट बैंड की पहचान करने के लिए आत्म ligated आधा linkers / या और adapters के amplicons. इसलिए, हम biotinylated आधा linkers और 454 GS20 एडेप्टर की एकाग्रता के लिए पीसीआर प्रवर्धन के दौरान गैर विशिष्ट बैंड को कम करने को कम कर दिया. निकटता ligation मात्रा 50 मिलीग्राम से 10 मिलीग्राम बाद शुद्धि चरणों के दौरान नमूना नुकसान को कम करने के लिए और भी अभिकर्मक लागत पर बचाने के लिए कम हो गया था. हम भी ऊष्मायन समय में वृद्धि हुई मोती Chia पीईटी डीएनए स्थिर streptavidin मोती के पर चिया पीईटी डीएनए की अधिक से अधिक पर कब्जा सुनिश्चित करने के.

निकटता ligation चरण के दौरान, chimeric था ligationsटी vivo chromatin बातचीत में सच का प्रतिनिधित्व नहीं कर रहे हैं अनिवार्य रूप से एक गैर विशिष्ट और बेतरतीब तरीके में उत्पन्न. इसलिए, किसी भी प्रयोग चिया पीईटी से डेटा की गुणवत्ता का मूल्यांकन करने, काइमेरावाद की दर दो विशिष्ट nucleotide बारकोड TAAG और ATGT ^{5 के} साथ विभिन्न आधा linkers के उपयोग से अनुमान लगाया गया है. उच्च throughput अनुक्रमण के बाद, चिया पीईटी दृश्यों 1 linker बारकोड संरचना और दृश्यों विशिष्ट ligation उत्पादों और गैर विशिष्ट ligation उत्पादों से प्राप्त के लिए विश्लेषण कर रहे हैं ⁸ प्रतिष्ठित किया जा सकता है. ज्ञात काइमेरा का प्रतिशत (यानी heterodimers एबी linkers) उपस्थित MCF-7 में हमारे घर में शाही सेना पोलीमरेज़ द्वितीय Chia पीईटी पुस्तकालयों से कम 15% है.

Chia पीईटी दृश्यों के बाद दो श्रेणियों, अर्थात् आत्म ligation जाते हैं और अंतर – ligation पालतू जानवर में वर्गीकृत कर रहे हैं. सेल्फ ligation जाते chromatin टुकड़े के ligation आत्म circularization से प्राप्त कर रहे हैं, जबकि अंतर – ligation जाते मैं से प्राप्त कर रहे हैंदो अलग डीएनए टुकड़े के बीच nter ligation. बाद तो एक ही गुणसूत्र (intrachromosomal पालतू जानवर अंतर ligation) पर या दोनों टैग दो अलग क्रोमोसोम (interchromosomal पालतू जानवर अंतर ligation) के लिए मैप किए जाते हैं कि प्रत्येक टैग के जीनोमिक दूरी के आधार पर तीन अलग – अलग श्रेणियों में उप विभाजित. हम एक उपकरण Chia पीईटी सॉफ्टवेयर के लिए बाहर तरह विभिन्न श्रेणियों के ⁸ पैकेज विकसित किया है. यह डीएनए टुकड़े कि पुस्तकालय में हैं के आधार पर किया जाएगा. आम तौर पर, छोटी चिप टुकड़े एक उच्च संकल्प दे और इन शाही सेना पोलीमरेज़ द्वितीय Chia पीईटी पुस्तकालयों के लिए काट 4 केबी के बारे में है.

इसके अलावा, एक बातचीत क्लस्टर में अंतर – ligation पालतू जानवरों की संख्या की गणना करके वास्तविक chromatin बातचीत यादृच्छिक शोर से प्रतिष्ठित किया जा सकता है, दूसरे शब्दों में, उच्च पीईटी गिनती के एक समूह के लिए एक वास्तविक chromatin ⁸ बातचीत होने की संभावना अधिक है कहा जाता है .

हमारे झूठी सकारात्मक फिल्टरसे वृद्धि अत्यधिक समृद्ध एंकर है जो यादृच्छिक मौका अंतर ligation पालतू जानवर के रूप में कर सकते हैं, एक सांख्यिकीय विश्लेषण रूपरेखा भी दो ⁸ एंकर के बीच किसी भी पालतू जानवर के अंतर ligation यादृच्छिक गठन के लिए खाते में तैयार किया गया.

अंत में, Chia पीईटी तकनीक एक वैश्विक स्तर पर chromatin बातचीत नेटवर्क मानचित्रण की अनुमति देता है. Chia पीईटी में चिप के कार्यान्वयन पुस्तकालय जटिलता और पृष्ठभूमि शोर की कमी की अनुमति देता है. इसके अलावा, चिप chromatin बातचीत के लिए विशिष्टता कहते हैं, विशिष्ट विशेष प्रतिलेखन ⁵ कारकों के साथ जुड़े chromatin बातचीत की परीक्षा को सक्षम.

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue Number	Comments
4-20% gradient TBE gel	Invitrogen	EC6225BOX	Step B, 6.3
5 x T4 DNA Ligase Buffer with PEG	Invitrogen	46300018	Step B, 2.2
6% TBE gel	Invitrogen	EC6263BOX	Step B, 6.8
Agilent DNA 100 Assay	Agilent Technologies	5067-1504	Step B, 7.1
Agilent High Sensitivity DNA Assay	Agilent Technologies	5067-4626
Agilent Bioanalyzer 2100	Agilent Technologies	G2940CA
Centrifuge Tube Filters (Spin-X)	Corning	CLS8160	Step B, 3.7 and 6.9
Dark Reader Transilluminator	Clare Chemical Research	DR46B	Step B, 6.8
Digital Sonifier Cell Disrupter	Branson	450D-0101063591	Step A, 4.3
DynaMag-2 magnet (Magnetic Particle Concentrator)	Invitrogen	123-21D	Step A, 7.5.1 Step B, for all magnetic beads washing steps
DynaMag-15 Magnet (Magnetic Particle Concentrator)	Invitrogen	123.01D	Step A, 5 and 6
DynaMag-PCR (Magnetic Particle Concentrator)	Invitrogen	49-2025	Step B, 6.5
Escherichia coli DNA Polymerase I	NEB	M0209	Step B, 5.6
GlycoBlue	Ambion	AM9516	Step A, 7.5.1 Step B, 4.3 and 6.5
Illumina cBot Cluster Generation System	Illumina	SY-301-2002	Step B, 7.4
Illumina Genome Analyzer IIx	Illumina	SY-301-1301	Step B, 7.5
Illumina PE primers	Illumina	PE-102-1004	Step B, 5.4 (if necessary)
Intelli-Mixer	Palico Biotech	RM-2L	Step B, any incubations with rotation
LightCycler 480 Real-Time PCR System	Roche	04 640 268 001	Step A, 7.5.3 Step B, 7.3
LightCycler480 DNA SYBR Green I MasterMix	Roche	03 752 186 001	Step B, 7.5.3
M-280 Streptavidin Dynabeads	Invitrogen	11206D	Step B, 5.2
Magnetic (Dynabeads) Protein G	Invitrogen	100.03D	Step A, 5.1.1 and 5.2.1
MaXtract High Density (2ml)	Qiagen	129056	Step A, 7.5.1
MaXtract High Density (50ml)	Qiagen	129073	Step B, 4.2
MmeI	NEB	R0637	R0637
RNase ONE Ribonuclease	Promega	M426C	Step B, 4.8
RNA Polymerase II (8WG16) monoclonal antibody	Covance	MMS-126R	Step A, 5.2.4
Oak Ridge Centrifuge Tubes (Polypropylene)	Nalgene	3119-0050	Step A, 3.1
Oak Ridge Centrifuge Tubes (Teflon FEP)	Nalgene	3114-0050	Step B, 4.3
Phusion High Fidelity Master Mix	Finnzymes	F-531	Step B, 6
Picogreen (Quant-iT) dsDNA Reagent	Invitrogen	P11495	Step A, 7.5.2
Polystyrene Round Bottom Test Tube	BD Biosciences	352057	Step A, 4.1
Protease Inhibitor Cocktail Tablets (cOmplete, EDTA-free)	Roche	11873580001	Step A, 1.6 onwards
Proteinase K Solution (20mg/ml)	Fermentas	E00491	Step A, 4.4, 7.5.1 Step B, 4.1
T4 DNA Ligase	Fermentas	EL0013	Step B, 2.2, 3.9 and 5.4
T4 DNA Ligase Buffer (NEB)	NEB	B0202S	Step B, 3.3 and 3.9
T4 DNA Polymerase	Promega	M4215	Step B, 1.2
T4 DNA Polynucleotide Kinase	NEB	M0201	Step B, 3.3
TruSeq SBS Kit v5–GA	Illumina	FC-104-5001	Regents for Illumina Genome Analyzer IIx system
TruSeq PE Cluster Kit v2–cBot–GA	Illumina	PE-300-2001	to be use with Illumina cBot Cluster Generation System
SYBR Green I	Invitrogen	S-7585	Step B, 6.3 and 6.8
XCell SureLock Mini-Cell Electrophoresis System	Invitrogen	EI0001	Step B, 6.3 and 6.8

Name	Sequence		Comments
Biotinylated half-linkers A (200ng/μl)	Top	5′ GG CCG CGA/iBiodT/ ATC TTA TCC AAC 3′	250 nmole scale HPLC Purified Internal Biotin dT(9)
	Bot	5′ GTT GGA TAA GAT ATC GC 3′	250 nmole scale HPLC Purified
Biotinylated half-linkers B (200ng/μl)	Top	5′ GGC CGC GA/iBiodT/ ATA CAT TCC AAC 3′	250 nmole scale HPLC Purified Internal Biotin dT(9)
	Bot	5′ GTT GGA ATG TAT ATC GC 3′	250 nmole scale HPLC Purified
Non-biotinylated half-linkers (200ng/μl)	Top	5′ GGC CGC GAT ATC GGA TCC AAC 3′	250 nmole scale PCR Grade
	Bot	5′ GTT GGA TCC GAT ATC GC 3′	250 nmole scale PCR Grade
GS20 Adaptor A (200ng/μl)	Top	5′ CCA TCT CAT CCC TGC GTG TCC CAT CTG TTC CCT CCC TGT CTC AGN N 3′	250 nmole scale PCR Grade
	Bot	5’CTG AGA CAG GGA GGG AAC AGA TGG GAC ACG CAG GGA TGA GAT GG 3′	250 nmole scale PCR Grade
GS20 Adaptor B (200ng/μl)	Top	5′ CTG AGA CAC GCA ACA GGG GAT AGG CAA GGC ACA CAG GGG ATA GG 3′	250 nmole scale PCR Grade
	Bot	5′ CCT ATC CCC TGT GTG CCT TGC CTA TCC CCT GTT GCG TGT CTC AGN N 3′	250 nmole scale PCR Grade
Illumina-NN adaptors	Top	5′ ACA CTC TTT CCC TAC ACG ACG CTC TTC CGA TC 3′	250 nmole scale HPLC purified See Step B, 5.4
	Bot	5′ phos – GAT CGG AAG AGC GGT TCA GCA GGA ATG CCG AG 3′	250 nmole scale HPLC purified Phosphorylated 5′ end See Step B, 5.4
Illumina 1-454 (forward) primer (10 μM)	5′ AAT GAT ACG GCG ACC ACC GAG ATC TAC ACC CTA TCC CCT GTG TGC CTT G 3′		250 nmole scale PCR Grade
Illumina 2-454 (reverse) primer (10 μM)	5′ CAA GCA GAA GAC GGC ATA CGA GAT CGG TCC ATC TCA TCC CTG CGT GTC 3′		250 nmole scale PCR Grade
qPCR Primer 1.1 (10 μM)	5′ AAT GAT ACG GCG ACC ACC GAG AT 3′		10nmole scale PCR Grade
qPCR Primer 2.1 (10 μM)	5′ CAA GCA GAA GAC GGC ATA CGA 3′		10nmole scale PCR Grade
Illumina 3-454 sequencing primer (100 μM)	5’TGC GTG TCC CAT CTG TTC CCT CCC TGT CTC AG 3′		100nmole scale HPLC Purified
Illumina 4-454 sequencing primer (100 μM)	5’GTG CCT TGC CTA TCC CCT GTT GCG TGT CTC AG 3′		100nmole scale HPLC Purified

Table of oligos and adaptors. Order oligos from Integrated DNA Technologies (IDT) and prepare linkers and adaptors in the same manner as described previously¹⁰. Half-linkers and adaptors may be prepared beforehand and stored for several months at -20 °C.