Zebrafish भ्रूण की Intracellular बैक्टीरियल रोगज़नक़ों के साथ संक्रमण

Summary

पारदर्शी zebrafish भ्रूण उपयोगी मॉडल कल्पना करने के लिए मेजबान और इस तरह के रूप में सहज प्रतिरक्षा कोशिकाओं और intracellular बैक्टीरियल रोगज़नक़ों के बीच में कार्यात्मक अध्ययन बातचीत, साबित कर दिया है<em> साल्मोनेला</em> और<em> माइकोबैक्टीरियम marinum</em>. बैक्टीरिया और बहु ​​रंग प्रतिदीप्ति इमेजिंग की माइक्रो इंजेक्शन आवश्यक तकनीक zebrafish भ्रूण संक्रमण मॉडलों के आवेदन में शामिल हैं.

Abstract

Zebrafish (Danio rerio) embryos are increasingly used as a model for studying the function of the vertebrate innate immune system in host-pathogen interactions ¹. The major cell types of the innate immune system, macrophages and neutrophils, develop during the first days of embryogenesis prior to the maturation of lymphocytes that are required for adaptive immune responses. The ease of obtaining large numbers of embryos, their accessibility due to external development, the optical transparency of embryonic and larval stages, a wide range of genetic tools, extensive mutant resources and collections of transgenic reporter lines, all add to the versatility of the zebrafish model. Salmonella enterica serovar Typhimurium (S. typhimurium) and Mycobacterium marinum can reside intracellularly in macrophages and are frequently used to study host-pathogen interactions in zebrafish embryos. The infection processes of these two bacterial pathogens are interesting to compare because S. typhimurium infection is acute and lethal within one day, whereas M. marinum infection is chronic and can be imaged up to the larval stage ^{2, 3}. The site of micro-injection of bacteria into the embryo (Figure 1) determines whether the infection will rapidly become systemic or will initially remain localized. A rapid systemic infection can be established by micro-injecting bacteria directly into the blood circulation via the caudal vein at the posterior blood island or via the Duct of Cuvier, a wide circulation channel on the yolk sac connecting the heart to the trunk vasculature. At 1 dpf, when embryos at this stage have phagocytically active macrophages but neutrophils have not yet matured, injecting into the blood island is preferred. For injections at 2-3 dpf, when embryos also have developed functional (myeloperoxidase-producing) neutrophils, the Duct of Cuvier is preferred as the injection site. To study directed migration of myeloid cells towards local infections, bacteria can be injected into the tail muscle, otic vesicle, or hindbrain ventricle ^4-6. In addition, the notochord, a structure that appears to be normally inaccessible to myeloid cells, is highly susceptible to local infection ⁷. A useful alternative for high-throughput applications is the injection of bacteria into the yolk of embryos within the first hours after fertilization ⁸. Combining fluorescent bacteria and transgenic zebrafish lines with fluorescent macrophages or neutrophils creates ideal circumstances for multi-color imaging of host-pathogen interactions. This video article will describe detailed protocols for intravenous and local infection of zebrafish embryos with S. typhimurium or M. marinum bacteria and for subsequent fluorescence imaging of the interaction with cells of the innate immune system.

Protocol

1. इंजेक्शन सुई तैयार Borosilicate ग्लास microcapillary इंजेक्शन सुई एक micropipette डांड़ी युक्ति है (Sutter उपकरण इंक, निम्नलिखित सेटिंग्स के साथ एक लंबी टिप के लिए / पी-97 ब्राउन ज्वलंत (हार्वर्ड उपकरण, 300,038, 1 मिमी आयुध डिपो × 0.78 मिमी ID) का उपयोग कर तैयार: हवा 400 दबाव; गर्मी 610, 40 पुल, 50 वेग, 30 समय एक छोटी टिप के लिए निम्नलिखित सेटिंग्स के साथ और हवा के दबाव 500, 510 गर्मी, 100 पुल, 200 वेग, 60 बार). ठीक चिमटी के साथ सुई टिप तोड़ 5-10 माइक्रोन का एक टिप खोलने व्यास प्राप्त करने के लिए. यह एक 45 डिग्री कोण microgrinder (Narishige इंक, उदाहरण के लिए-400) के लिए एक तेज टिप उपज के साथ सुई टिप खोलने के उठाव के लिए सलाह दी जाती है. यह epidermal परत puncturing की सुविधा और इस तरह कुंद सुइयों के साथ तुलना में कम ऊतकों को नुकसान के साथ और अधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य इंजेक्शन में परिणाम देगा. लंबे समय तक इत्तला दे दी सुई दुम का (चरण 5) नस और कुवियर की वाहिनी (6.1 कदम) इंजेक्शन और कम इत्तला दे दी सुई के लिए पसंद कर रहे हैंअन्य इंजेक्शन प्रोटोकॉल (कदम 6.2-6.6) के लिए पसंद कर रहे हैं. 2. एस तैयार typhimurium Inoculum एस बाहर थाली -80 ° C ग्लिसरॉल स्टॉक से लेग अगर प्लेट पर typhimurium (प्रतिदीप्ति अभिव्यक्ति वैक्टर के लिए चयन उपयुक्त एंटीबायोटिक दवाओं के साथ) और 37 पर रात में सेते हैं डिग्री सेल्सियस व्यक्तिगत fluorescently सकारात्मक कालोनियों उठाओ और उन्हें बाँझ फॉस्फेट-buffered खारा (पीबीएस) में वांछित एकाग्रता (5 प्रोटोकॉल और 6 को देखें) resuspend, वैकल्पिक 0.085% (v / v) युक्त phenol के लाल (सिग्मा Aldrich) के दृश्य के लिए सहायता इंजेक्शन प्रक्रिया. सीधे इंजेक्शन के लिए ताजा निलंबन का उपयोग करने के लिए या ग्लिसरॉल स्टॉक तैयार है. ग्लिसरॉल स्टॉक तैयार करने के लिए, नीचे बैक्टीरिया की वांछित एकाग्रता के साथ ताजा बना इंजेक्शन स्टॉक स्पिन और पीबीएस में बाँझ 20% ग्लिसरॉल (v / v) (सिग्मा Aldrich) में 1/2 शुरू मात्रा में गोली resuspending द्वारा स्टॉक ध्यान केंद्रित. -8 में ग्लिसरॉल स्टॉक स्टोर0 ° सी. पतला ग्लिसरॉल स्टॉक (v / v) 01:01 बाँझ पीबीएस में इंजेक्शन से पहले, वैकल्पिक 0.17% phenol के लाल युक्त. भंवर जीवाणु निलंबन कणों का जैसे जीवाणुओं का पिण्ड के रूप में एकत्रित हो जाना अच्छी तरह से बचने के लिए. Microcapillary microloader टिप (Eppendorf, 5242956.003) का उपयोग कर सुई में inoculum लोड करें. एस के अपेक्षाकृत बड़े आकार के कारण typhimurium बैक्टीरिया और उनके उज्ज्वल डी लाल प्रतिदीप्ति जब pGMDs3 अभिव्यक्ति 3 वेक्टर (अनुरोध पर उपलब्ध तनाव) का उपयोग कर, व्यक्तिगत बैक्टीरियल कोशिकाओं को आसानी से एक प्रतिदीप्ति stereomicroscope साथ गिना जा सकता है क्रम में इंजेक्शन खुराक निर्धारित करने के लिए. यह अंत करने के लिए, अगर प्लेट पर पीबीएस की एक बूंद में 1 nl, इंजेक्षन फ्लोरोसेंट बैक्टीरिया गिनती, और इंजेक्शन मात्रा की गणना है कि वांछित जीवाणु (खुराक अधिमानतः 1-2 nl के बीच इंजेक्शन की मात्रा रखने के) प्राप्त करने के लिए आवश्यक है. एस के साथ भ्रूण इंजेक्षन typhimurium के माध्यम से चयनित मार्ग (प्रोटोकॉल 5 और 6 को देखें). 3. तैयार करना <eमीटर> एम. Inoculum marinum एम. रखें marinum Difco Middlebrook 7H10 अगर पर बढ़ रहा तनाव (बी और कंपनी) के साथ में 10% एसिड – albumin द्रक्षौज catalase के ओलिक (OADC, बी.डी. और कंपनी), 0.5% ग्लिसरॉल, और उचित एंटीबायोटिक दवाओं के साथ पूरक करने के लिए लिए प्रतिदीप्ति अभिव्यक्ति वैक्टर (उपलब्ध उपभेदों का चयन करें 9 अनुरोध) पर है, इसलिए वहाँ हमेशा एक ताजा स्टॉक है. एम. की एक कॉलोनी उठाओ Difco Middlebrook 7H9 शोरबा (बी और कंपनी) 80 10% albumin – द्रक्षौज catalase (एडीसी, बी.डी. और कंपनी) और 0.05% के बीच (सिग्मा Aldrich) और उचित एंटीबायोटिक दवाओं के साथ पूरक में marinum और यह resuspend है. जाँच करें कि 600 एनएम ऑप्टिकल घनत्व (ओवर ड्राफ्ट) 0.2 – 0.3 और 28.5 पर यह स्थिर रुप से रातोंरात बढ़ने ° सी. एम. की पीढ़ी समय marinum लगभग 4-6 घंटे है, तनाव के अनुसार अलग. 600 एनएम ओवर ड्राफ्ट उपाय फिर इंजेक्शन के दिन पर. 1 के एक OD600 लगभग 10 8 एम. से मेल खाती है marinum एमएल /(इस बैक्टीरिया का इस्तेमाल किया तनाव के अनुसार भिन्न है और इस तरह हो सकता है विशेष रूप से तनाव के लिए एक विकास वक्र पर आधारित होना चाहिए). बैक्टीरिया फसल जब वे centrifuging और उन्हें धोने बाँझ पीबीएस में तीन बार के द्वारा लघुगणक चरण (OD600 1.00 से अधिक नहीं) में हैं. OD600 पीबीएस में जीवाणु निलंबन की फिर से मापने के लिए, नीचे स्पिन और पीबीएस में या 2% Polyvinylpyrrolidone में वांछित (5 प्रोटोकॉल और 6 को देखें) एकाग्रता (PVP40) में पीबीएस में (w / वी), जो एकरूपता में सुधार करने के लिए बैक्टीरिया resuspend जीवाणु निलंबन की. के phenol लाल (सिग्मा Aldrich) 0.085% की एकाग्रता इंजेक्शन प्रक्रिया के दृश्य सहायता के लिए जोड़ा जा सकता है. सीधे इंजेक्शन के लिए ताजा निलंबन का उपयोग करने के लिए या ग्लिसरॉल स्टॉक तैयार है. तैयार करने के लिए के लिए है ग्लिसरॉल शेयरों नीचे ताजा बना बैक्टीरिया की वांछित एकाग्रता के साथ इंजेक्शन स्टॉक स्पिन और पीबीएस में बाँझ 20% ग्लिसरॉल में 1/2 शुरू मात्रा में गोली resuspending द्वारा स्टॉक ध्यान केंद्रित. Glyc स्टोर-80 में Erol शेयर डिग्री सेल्सियस बाँझ पीबीएस में ग्लिसरॉल स्टॉक (v / v) 01:01, वैकल्पिक रूप से PVP40 और / या 0.17% phenol के लाल 4% से युक्त पतला. 4. इंजेक्शन के लिए Zebrafish भ्रूण तैयार Zebrafish प्रजनन जोड़े सेट और भ्रूण जमा के रूप में अन्य वीडियो 10 लेख में दिखाया. अंडा (60 μg / एमएल सागर लवण, कैरियर के 60 भ्रूण / पकवान) पानी से भरा एक पेट्री डिश में भ्रूण रखें और 28.5 पर सेते हैं डिग्री सेल्सियस यदि आवश्यक हो, 0.003% एन Phenylthiourea जोड़ें (पी टी यू, सिग्मा Aldrich) अंडा पानी के लिए जब भ्रूण लगभग 12 HPF melanization रोकने के. लगभग 24 घंटे के बाद (HPF) निषेचन, dechorionate का ठीक चिमटी (ठीक साइंस उपकरण इंक, Dumont # 5 संदंश के साथ भ्रूण Inox जीवविज्ञान. एक पेट्री डिश में अंडे पानी के साथ और तल पर agarose 1% की एक परत करने के लिए प्लास्टिक की सतह से चिपके से भ्रूण को रोकने के साथ भरा भ्रूण रखें. 200 μg / एमएल के साथ भ्रूण चतनाशून्य करना बफर 3Aminobenzoic एसिड (Tricaine, सिग्मा Aldrich) लगभग 10 इंजेक्शन के लिए पूर्व मिनट. 5. एक दिन पुराने भ्रूण में बैक्टीरिया की नसों में इंजेक्शन लगातार रक्त परिसंचरण के लिए जाँच, आंख, एक सीधे पूंछ में pigmentation की शुरुआत है, और दिल सिर्फ औदरीयता आँख करने के लिए तैनात किया जा रहा द्वारा 28 HPF 11 पर भ्रूण चरण. भ्रूण चतनाशून्य करना, 4.5 कदम देखना. बैक्टीरियल inoculum microloader टिप का उपयोग कर के साथ सुई लोड. (Sutter साधन, MM-33) के micromanipulator एक स्टैंड से जुड़े (विश्व परिशुद्धता उपकरण, M10L चुंबकीय स्टैंड) पर लोड सुई माउंट और एक स्टीरियो माइक्रोस्कोप (M50 के Leica, achromat के उद्देश्य 1x 0,15 एनए, प्रेषित प्रकाश बेस के तहत स्थिति TL) अनुसूचित जनजाति. इंजेक्शन 0.2 है करने के लिए समय और मुआवजा दबाव से 15 इंच (Eppendorf, Femtojet) सेट करें. सुई के लिए सही इंजेक्शन की मात्रा प्राप्त करने के लिए 700 और 900 इंच के बीच इंजेक्शन के दबाव को समायोजित करने के लिएइस्तेमाल किया. ड्रॉप आकार समायोजित करने के लिए एक खुर्दबीन स्लाइड पर या आंख में एक पैमाने पर पट्टी की मदद से वांछित व्यास मैच. दृढ़ संकल्प के लिए आकार ड्रॉप एक खुर्दबीन स्लाइड पर खनिज तेल में अंतःक्षिप्त किया जा सकता है, या आकार हवा है, जो सुई की नोक पर फांसी ड्रॉप पत्ते में इंजेक्शन द्वारा अनुमान लगाया जा सकता है. 1 nl की एक बूंद की त्रिज्या 0.062 मिमी (वी = 3/4 π 3, r) है. सही स्थिति में भरी हुई सुई के साथ micromanipulator सेट (इंजेक्शन थाली की सतह के लिए सम्मान के साथ एक 45 ° कोण पर यानी लगभग) इंजेक्शन से पहले और केवल यह आगे और पीछे ले जाने के लिए इंजेक्षन. anesthetized भ्रूण एक फ्लैट 1% agarose इंजेक्शन थाली और अधिक अंडा पानी के हटा दिया गया है पर pipetted कर रहे हैं, सतह के तनाव को इंजेक्शन के दौरान जगह में भ्रूण पकड़ करने के लिए अनुमति देता है. एक बाल पाश (चित्रा 2) उपकरण का प्रयोग करने के लिए भ्रूण लाइन. इंजेक्शन के दौरान इंजेक्शन हाथ से थाली करने के लिए पसंदीदा स्थान में inserti के लिए भ्रूण जगह ओरिएंटएनजी सुई टिप की ओर इशारा करते हुए उनके पूंछ के साथ सुई अर्थात्. दुम का नस मूत्रजननांगी (चित्रा 1 ए) खोलने, बींधना सुई टिप के साथ periderm के करीब ऊपर सीधे सुई टिप प्लेस और बैक्टीरिया का वांछित खुराक इंजेक्षन, हम ca का उपयोग करें. एस के 250 CFU typhimurium जंगली प्रकार (wt) SL1027 तनाव, डी एस – लाल अभिव्यक्ति वेक्टर pGMDs3, और क्षमताओं से युक्त. एम. के 120 CFU marinum Mma20 तनाव. इंजेक्शन जीवाणु निलंबन दिल की ओर दुम का नस के माध्यम से रक्त के प्रवाह का पालन करेंगे. मॉनिटर अगर इंजेक्शन 2 नाड़ी के बाद सीधे संवहनी प्रणाली की एक विस्तार मात्रा के लिए जाँच के द्वारा सही ढंग से किया गया था. खुराक प्रतिक्रिया प्रयोगों के लिए, 2-3 लगातार इंजेक्शन की सुई निकालने के बिना किया जा सकता है. प्रयोग के दौरान अक्सर पूछे जाने वाले जाँच है कि इंजेक्शन की मात्रा को एक ही रहता है. प्रयोग भर इंजेक्शन की स्थिरता के लिए एक नियंत्रण प्रदान करने के लिए, एक dro इंजेक्षनबैक्टीरिया के लगभग हर 30 वें भ्रूण इंजेक्शन के बाद एक जीवाणु वृद्धि मध्यम पर बाँझ पीबीएस ड्रॉप में सीधे पी. इस ड्रॉप बाहर प्लेट और ऊष्मायन के बाद बैक्टीरियल कालोनियों की गिनती के लिए इंजेक्शन की मात्रा में कॉलोनी बनाने इकाइयों (CFU) के निर्धारित है. एक प्रतिदीप्ति stereomicroscope (7 प्रोटोकॉल) का प्रयोग करने के लिए व्यक्तिगत फ्लोरोसेंट एस निरीक्षण typhimurium कोशिकाओं को इंजेक्शन के बाद सीधे खून में परिसंचारी, और भ्रूण कि ठीक से नहीं इंजेक्ट कर रहे हैं त्यागें. व्यक्तिगत फ्लोरोसेंट एम. marinum बैक्टीरिया इंजेक्शन के बाद सीधे स्टीरियो प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा मनाया जा सकते हैं, लेकिन संक्रमित कोशिकाओं की फ्लोरोसेंट समुच्चय 2 दिनों के बाद संक्रमण (डीपीआई) द्वारा दिखाई हो सकता है और समय के साथ बड़ा हो जाना चाहिए. 6. संक्रमण के वैकल्पिक मार्ग कुवियर इंजेक्शन वाहिनी: एक फ्लैट दुम का नस इंजेक्शन के लिए के रूप में 1% agarose इंजेक्शन थाली (5.6 देखें) पर संवेदनाहृत भ्रूण रेखा से ऊपर (2-3 DPF). ओरिएंट इंजेक्षनआयन थाली हाथ से सुई डालने के लिए पसंदीदा स्थान में भ्रूण यानी तिरछे के तहत जगह, इंजेक्शन के दौरान एक 45 ° कोण ताकि कुवियर की वाहिनी भ्रूण के पृष्ठीय ओर से सुई टिप द्वारा संपर्क किया जा सकता है (चित्रा 1 बी) . कुवियर का स्थान जहां वाहिनी की जर्दी थैली पर विस्तार शुरू होता है और 100-200 बैक्टीरिया (1-3 nl) इंजेक्षन पृष्ठीय वाहिनी के प्रारंभिक बिंदु में सुई डालें. इंजेक्शन सही है अगर वाहिनी के भीतर मात्रा नाड़ी के बाद सीधे और जर्दी थैली नहीं उठी है फैलता है. दुम का नस इंजेक्शन (5.7 देखें) के लिए के रूप में, कई लगातार इंजेक्शन सुई निकालने के बिना किया जा सकता है. Hindbrain निलय इंजेक्शन: (32 HPF) संवेदनाहृत भ्रूण के ऊपर एक फ्लैट 1% agarose इंजेक्शन जैसे कि भ्रूण सुई टिप के प्रति उनके पृष्ठीय पक्ष के साथ तैनात कर रहे हैं थाली पर लाइन. Hindbrain निलय में एक पूर्वकाल स्थिति से neuroe छू बिना सुई डालें(चित्रा 1C) pithelium और 20-100 बैक्टीरिया (0.5-1 nl) इंजेक्षन. प्रक्रिया अभ्यास, एक फ्लोरोसेंट डाई का उपयोग करें (जैसे टेक्सास लाल Dextran) के रूप में एक और वीडियो अनुच्छेद 13 में दिखाया गया. पूंछ पेशी इंजेक्शन: स्थिति संवेदनाहृत भ्रूण दुम का नस इंजेक्शन के लिए के रूप में (1-2 DPF) (5.6 देखें). लगभग 65 ° का एक कोण को इंजेक्शन थाली सतह के लिए सम्मान के साथ भरी हुई सुई के साथ micromanipulator समायोजित करें. मूत्रजननांगी खोलने (चित्रा 1D) ऊपर मांसपेशी में पृष्ठदंड या रक्त वाहिकाओं को नुकसान कारण के बिना 50 CFU – एक जीवाणु निलंबन 20 (0.5-1 nl) युक्त इंजेक्षन. कान का पुटिका इंजेक्शन: स्थिति दुम का नस इंजेक्शन के लिए के रूप संवेदनाहृत (2-3 DPF) भ्रूण (5.6 देखें). लगभग 65 ° का एक कोण को इंजेक्शन थाली सतह के लिए सम्मान के साथ भरी हुई सुई के साथ micromanipulator समायोजित करें. कान का पुटिका (चित्र 1E) में कम प्रेस के साथ लगभग 20 बैक्टीरिया (0.5 nl) इंजेक्षनस्थानीय ऊतक टूटना से बचने के ure. पृष्ठदंड इंजेक्शन: (1-2 DPF) anesthetized भ्रूण के ऊपर एक फ्लैट 1% agarose इंजेक्शन जैसे कि भ्रूण अपनी पूंछ से दूर ओर इशारा करते हुए सुई टिप के साथ तैनात कर रहे हैं थाली पर लाइन. पृष्ठदंड (चित्र 1F) में पूंछ मांसपेशियों के ऊतकों के माध्यम से सुई डालें और लगभग 20-50 बैक्टीरिया (अधिक से अधिक 0.5 nl) इंजेक्षन. ध्यान रखना बहुत अधिक मात्रा नहीं इंजेक्षन करने के लिए पृष्ठदंड का टूटना से बचने के. जर्दी इंजेक्शन: 16 1000 सेल स्तर पर स्थिति आयताकार या वी के आकार में एक चैनल 12 ढालना या ऑनलाइन के साथ बने चैनल के साथ एक 1% agarose इंजेक्शन प्लेट पर भ्रूण युक्त अंडे http://zfin.org/zf_info/zfbook/chapt5 / 5.1.html . Pierce की जर्दी (चित्र 1G) के केंद्र में जरायु के माध्यम से सुई और 20-40 बैक्टीरिया इंजेक्षन (1-2 nl). जीवाणु निलंबन के लिए 2% PVP40 वाहक समाधान का उपयोग करें (3.5 कदम देखें)भ्रूण में जल्दी जीवाणु प्रसार को रोकने के लिए महत्वपूर्ण है. 7. संक्रमण के स्टीरियो इमेजिंग एक 1% agarose स्तरित पेट्री डिश अंडा Tricaine (4.5 देखें) युक्त पानी के साथ कवर में संक्रमित भ्रूण चतनाशून्य करना. एक बाल पाश (चित्रा 2) उपकरण के साथ एक प्रतिदीप्ति स्टीरियो माइक्रोस्कोप के तहत इमेजिंग के लिए सही स्थिति में भ्रूण संरेखित करें. इससे पहले कि तैरना मूत्राशय फुलाया गया है (1-5 DPF), भ्रूण अपने पक्ष पर फ्लैट झूठ पार्श्व दृश्य इमेजिंग सक्षम होगा. यदि पार्श्व दृश्य से एक अलग स्थान की आवश्यकता है, 1.5% मिथाइल सेलूलोज़ में भ्रूण माउंट. एक बाल पाश (चित्रा 2) उपकरण के साथ आवश्यक स्थिति में भ्रूण में हेरफेर. अंडे पानी के लिए इमेजिंग के बाद भ्रूण लौटें. 8. संक्रमण की confocal इमेजिंग एक गिलास नीचे पर कम गलनांक agarose (LONZA इंक, अंडे पानी में 1.5% (w / वी)) की एक बूंद प्लेस(WILLCO वेल्स, – 5040 GWSt) के WILLCO पकवान अगर एक औंधा confocal सूक्ष्मदर्शी का प्रयोग किया जाता है, या एक एकल गुहा अवसाद स्लाइड (अगर वैज्ञानिक, L4090) पर अगर एक ईमानदार confocal सूक्ष्मदर्शी का प्रयोग किया जाता है. Agarose बूंद में अंडा पानी की सीमित मात्रा के साथ संवेदनाहृत भ्रूण प्लेस और एक बाल पाश उपकरण (चित्रा 2) के साथ स्थिति में भ्रूण हेरफेर. जब एक उलटा माइक्रोस्कोप का उपयोग करते हुए यह महत्वपूर्ण है कि ब्याज के भ्रूण क्षेत्र इमेजिंग पकवान की गिलास नीचे के खिलाफ फ्लैट है. एक ईमानदार माइक्रोस्कोप पानी विसर्जन या लंबी दूरी की सूखी उद्देश्यों के साथ संयोजन में इस्तेमाल किया जा सकता है और भ्रूण है कि इस तरह के हित के क्षेत्र के रूप में संभव के रूप में उद्देश्य के करीब है तैनात किया जाना चाहिए. Agarose जमना और अंडे Tricaine (4.5 देखें) युक्त पानी में डूब agarose ड्रॉप. यदि एक ईमानदार माइक्रोस्कोप का इस्तेमाल किया जाता है, अवसाद गुहा (हवाई बुलबुले के रूप में की अनुमति नहीं है) के शीर्ष पर एक गिलास को कवर पर्ची जगह है. क्रमिक रूप से फ्लू के अधिग्रहणorescence और प्रसारण छवियों. ध्यान से ठीक चिमटी के साथ भ्रूण से agarose और हटाने भ्रूण वापस अंडा पानी में अगर यह आगे के प्रयोगों के लिए आवश्यक है जगह. 9. प्रतिनिधि परिणाम 1 मैक्रोफेज द्वारा तेजी से phagocytosis में DPF परिणाम में भ्रूण के रक्त द्वीप में साल्मोनेला या माइकोबैक्टीरियम marinum बैक्टीरिया के इंजेक्शन. MPEG1 जीन हाल ही में भ्रूण मैक्रोफेज के एक वफादार मार्कर के रूप में पहचान की गई है, अच्छी तरह से स्थापित है बृहतभक्षककोशिका मार्कर csf1r (एफएमएस) के साथ colocalizing (MPO) MPX और 4 lyz, 14 के रूप में न्युट्रोफिल मार्कर के साथ अतिव्यापी नहीं है. बैक्टीरियल phagocytosis रहते इमेजिंग के लिए हम ट्रांसजेनिक लाइनों में जो mpeg1 प्रमोटर 14 मैक्रोफेज में फ्लोरोसेंट प्रोटीन अभिव्यक्ति ड्राइव का इस्तेमाल किया है. इन ट्रांसजेनिक लाइनों या तो MPEG1 प्रमोटर चGFP जीन को सीधे प्रयोग किया जाता है, या एक प्रणाली दो घटक है, जहां. MPEG1 प्रमोटर में खमीर Gal4 प्रतिलेखन कारक है कि Gal4 मान्यता (यूएएस, नदी के ऊपर अनुक्रम सक्रिय) अनुक्रम kaede जीन के लिए जुड़े हुए के साथ एक दूसरे transgene सक्रिय अभिव्यक्ति ड्राइव को रोजगार. जब रक्त द्वीप इंजेक्शन (5 प्रोटोकॉल, चित्रा 1 ए) सही ढंग से किया जाता है, बैक्टीरिया तुरंत रक्त परिसंचरण के माध्यम से प्रवाह होगा और भ्रूण भर में फैला है. अपेक्षाकृत बड़े और चमकीले फ्लोरोसेंट डी एस लाल लेबल एस का प्रचार – प्रसार typhimurium बैक्टीरिया एक स्टीरियो प्रतिदीप्ति खुर्दबीन (चित्रा 3A), और 2 hpi शो में confocal इमेजिंग कि कई बैक्टीरिया फ्लोरोसेंट मैक्रोफेज (चित्र 3B सी) द्वारा phagocytosed के साथ सीधे imaged किया जा सकता है. जंगली प्रकार एस के रूप में छोटा रूप में 25 CFU का इंजेक्शन typhimurium बैक्टीरिया घातक संक्रमण में परिणाम होगा, जबकि एक असंक्रामक है के जीवाणुओं की एक समान खुराकरा के रूप में ट्रेन, भ्रूण प्रतिरक्षा प्रणाली को 3 से साफ किया जा सकता है. 250 CFU का एक इंजेक्शन की खुराक एस transcriptional प्रतिक्रियाओं का निर्धारण करने के लिए इस्तेमाल किया गया था typhimurium संक्रमण zebrafish भ्रूण में और एक मजबूत समर्थक भड़काऊ जीन अभिव्यक्ति 15 प्रतिक्रिया की प्रेरण का प्रदर्शन. इसके विपरीत, एम. की नसों में इंजेक्शन marinum बैक्टीरिया एक मजबूत समर्थक भड़काऊ प्रतिक्रिया नहीं प्रकाश में लाना करता, लेकिन एक लगातार संक्रमण जहां संक्रमित मेक्रोफेज तंग समुच्चय है कि granulomas की प्रारंभिक दौर है, जो 2 तपेदिक की पहचान कर रहे हैं के रूप में माना जाता है के रूप में करने के लिए होता है. Gl22 में 5 14 लाइन डीपीआई mCherry लेबल एम. के intracellular वृद्धि से पता चलता है: ग्रेन्युलोमा की तरह इस तरह टीजी में कुल (EGFP MPEG1) के confocal इमेजिंग marinum बैक्टीरिया हरी फ्लोरोसेंट मैक्रोफेज अंदर (चित्रा 3 डी ई). ओ.टी.उसे संक्रमण के मार्गों को विभिन्न प्रयोजनों के लिए उपयोगी होते हैं. बैक्टीरिया 32 (चित्रा 1C) HPF, जो एक मैक्रोफेज से रहित कम्पार्टमेंट है में hindbrain वेंट्रिकल में अंतःक्षिप्त किया जा सकता है. 20-100 mCherry लेबल एम. इंजेक्शन इस डिब्बे में marinum बैक्टीरिया मैक्रोफेज कि बैक्टीरिया (4A चित्रा) phagocytose द्वारा तेजी से घुसपैठ की ओर जाता है. एक अन्य विधि निर्देशित प्रवास सहज प्रतिरक्षा कोशिकाओं के अध्ययन के जीवाणुओं की पूंछ मांसपेशी (चित्रा 1D) में इंजेक्शन है. हालांकि, पूंछ पेशी इंजेक्शन भी है कि स्वयं के द्वारा leukocytes के कुछ आकर्षण elicits में ऊतकों को नुकसान का कारण. इस तरह के लोग घायल हो गए प्रतिक्रिया जब ध्यान से कान का पुटिका (चित्र 1E) में एक छोटी मात्रा (0.5-1 nl) इंजेक्शन लगाने से बचा जा सकता है. I114 16 लाइन, एस के लगभग 20 CFU का इंजेक्शन: टीजी (EGFP MPX) का उपयोग करके यहाँ दिखाया कान का पुटिका में typhimurium के HPI में 3 neutrophils के आकर्षण की ओर जाता है ( <strong> चित्र 4D), जबकि इस प्रतिक्रिया में पीबीएस नियंत्रण इंजेक्शन (चित्रा 4E) में नहीं मनाया जाता है. पृष्ठदंड, जो leukocytes द्वारा घुसपैठ के लिए प्रतिरोधी होना प्रतीत होता है एम. के विकास के लिए एक स्वतंत्र डिब्बे दृढ़ता से तनु marinum म्यूटेंट है कि जब अन्य 7 ऊतकों में इंजेक्शन, (चित्रा 4F). अंत में, एम. के प्रारंभिक इंजेक्शन भ्रूण की जर्दी में marinum एक प्रणालीगत संक्रमण प्राप्त करने के लिए एक वैकल्पिक विधि प्रदान करता है. हम आम तौर पर 16 सेल चरण (चित्रा 1G) के आसपास इन इंजेक्शनों का प्रदर्शन है, लेकिन जर्दी में बैक्टीरिया इंजेक्शन भी बाद में चरणों में किया जा सकता है (1000 सेल चरण के लिए), या पहले के लिए (1 से 8 सेल चरण) के सह – इंजेक्शन 8 morpholinos साथ. 20-40 CFU, एम. की एक खुराक के बाद जर्दी इंजेक्शन marinum बैक्टीरिया भ्रूण के ऊतकों और ग्रेन्युलोमा तरह के फार्म का समुच्चय पारंपरिक पर मनाया उन लोगों के लिए समान में कई दिनों में फैलानसों में इंजेक्शन विधि 8; (चित्रा 4G). जर्दी इंजेक्शन विधि एस के लिए उपयुक्त नहीं है typhimurium संक्रमण, क्योंकि जर्दी में तेजी से विकास जल्दी मारक का कारण बनता है. एम. के लिए जर्दी संक्रमण विधि marinum संक्रमण उच्च throughput अनुप्रयोगों के लिए उपयोगी हो सकता है क्योंकि यह एक इंजेक्शन 8 रोबोट का उपयोग कर स्वचालित किया जा सकता है. आकृति 1. एक तेजी से प्रणालीगत संक्रमण की स्थापना के लिए zebrafish भ्रूण में प्रणालीगत या स्थानीय संक्रमण की स्थापना के लिए इस्तेमाल किया इंजेक्शन तरीकों का अवलोकन (एबी). अंतःशिरा इंजेक्शन दुम का नस में 1 DPF (ए) में पीछे रक्त द्वीप पर या वाहिनी की कुवियर में में प्रदर्शन कर रहे हैं 2-3 DPF (B). (CE) बृहतभक्षककोशिका और न्युट्रोफिल chemotaxis अध्ययन के लिए स्थानीय इंजेक्शन hindbrain निलय में 1 DPF (सी) में प्रदर्शन कर रहे हैं, 1-2 (डी) DPF या 2-3 DPF (ई) में कान का पुटिका पर पूंछ पेशी (एफ) के लिए जाहिरा तौर पर एक दुर्गम phagocytes के लिए संक्रमण बनाने के इंजेक्शन पृष्ठदंड में 1-2 DPF पर प्रदर्शन कर रहे हैं. (D) इंजेक्शन एम. के रूप में धीमी गति से बढ़ रही बैक्टीरिया के साथ एक प्रारंभिक प्रणालीगत संक्रमण बनाने के लिए marinum 16-1000 सेल मंच पर जर्दी में प्रदर्शन किया जा सकता है. सभी छवियों को एक Leica M165C, PLANAPO 1.0X एक Leica DFC420 कैमरा (Leica 0.8x 10,446,307) से जुड़े के साथ ले जाया गया. चित्रा 2. बाल पाश उपकरण. मानव बाल की एक टुकड़ा एक पाश्चर विंदुक के खोलने में एक पाश के रूप में डाला जाता है और सुपर गोंद के साथ या Tipp पूर्व के साथ जगह में तय की. यह धीरे नाजुक zebrafish भ्रूण से छेड़छाड़ के लिए एक सुविधाजनक उपकरण प्रदान करता है. चित्रा 3. नसों में इंजेक्शनलाल फ्लोरोसेंट साल्मोनेला और माइकोबैक्टीरियम marinum. डी एस के लाल लेबल एस. typhimurium SL1027 (एसी) बैक्टीरिया और mCherry के लेबल एम. gl24, टीजी (यूएएस E1B: Kaede): marinum Mma20 बैक्टीरिया (डे) टीजी की रक्त द्वीप Gal4 – VP16 MPEG1 में अंतःक्षिप्त थे (एसी) s1999t या टीजी (MPEG1: EGFP) के 28 में gl22 (डे) zebrafish भ्रूण HPF. (ए) स्टीरियो प्रतिदीप्ति और उज्ज्वल क्षेत्र उपरिशायी एस के प्रसार दिखा छवि 2 hpi (Leica MZ16FA खुर्दबीन साथ Leica DFC420C कैमरा) में रक्त परिसंचरण में typhimurium. (ईसा पूर्व) Confocal Z-ढेर दिखा अनुमानों लाल एस. typhimurium बैक्टीरिया 2 hpi (Leica टीसीएस विशेष, HCX एपीओ उद्देश्य 40x 0.8 एनए) में हरी मैक्रोफेज द्वारा phagocytosed. बैक्टीरिया है कि अभी भी कर रहे हैं कोशिकी भी देखा जा सकता है. (डी) Confocal Z-ढेर एक ग्रेन्युलोमा तरह एम. युक्त कुल दिखा प्रक्षेपण 5 डीपीआई (Leica टीसीएस विशेष, HCX एपीओ 40x पर marinum Mma20 संक्रमित और uninfected मैक्रोफेज0.8 एनए). हरे रंग और लाल रंग में बैक्टीरिया में मैक्रोफेज. (ई) एक व्यक्ति बृहतभक्षककोशिका Confocal Z-ढेर साथ intracellular एम. (हरा) प्रक्षेपण marinum बैक्टीरिया (लाल). सफेद आयत द्वारा डी में चित्रित क्षेत्र के एक उच्च बढ़ाई उद्देश्य (Leica टीसीएस विशेष, HCX पी एल ए पी ओ 63x एनए 1.2) के साथ imaged किया गया था. Scalebars: 20 माइक्रोन. चित्रा 4. Zebrafish भ्रूण के संक्रमण के लिए वैकल्पिक मार्गों (ए) एम. mCherry लेबल. marinum Mma20 बैक्टीरिया hindbrain निलय में 32 HPF में अंतःक्षिप्त थे. प्रतिदीप्ति और प्रसारण उपरिशायी mCherry लेबल 5 (Leica टीसीएस विशेष, HCX पी एल Fluo 40.0x टीएआर 0.7 NA) hpi में मैक्रोफेज द्वारा phagocytosed बैक्टीरिया दिखा छवि. (बी) एस. typhimurium 1 DPF पर पूंछ मांसपेशियों में अंतःक्षिप्त किया गया था. इंजेक्शन साइट (सफेद वृत्त) माइलॉयड कोशिकाओं के आकर्षण 3 hpi पर च द्वारा दिखाया जाता हैस्वस्थानी संकरण 4, (सी) uninjected भ्रूण में जबकि सामान्य रूप से कर रहे हैं यह रूपात्मक साइट पर नहीं माइलॉयड कोशिकाओं में luorescent. हालांकि भ्रूण परिपक्व neutrophils इस स्तर पर शामिल नहीं है, माइलॉयड कोशिकाओं के दो आबादियों को प्रतिष्ठित किया जा सकता है, बृहतभक्षककोशिका मार्कर (लाल) mfap4 और न्युट्रोफिल मार्कर (हरा) MPX (Leica टीसीएस विशेष, कोर्ट पी एल FLUOTAR 10.0x व्यक्त व्यक्त 0.3 एनए). जीवाणुओं की प्रतिदीप्ति स्वस्थानी संकरण प्रक्रिया में खो दिया है. (डी) डी एस के लाल लेबल एस. 2 DPF पर i114 zebrafish: typhimurium बैक्टीरिया टीजी के कान का पुटिका (EGFP MPX) में अंतःक्षिप्त थे. स्टीरियो प्रतिदीप्ति और उज्ज्वल क्षेत्र उपरिशायी छवियों को दिखाने कि MPX: EGFP लेबल neutrophils कोशिकाओं 3 hpi में संक्रमित कान का पुटिका (डॉटेड दीर्घवृत्त) को आकर्षित कर रहे हैं, (ई) (टीजी के कान का पुटिका में पीबीएस के नियंत्रण इंजेक्शन जबकि MPX: EGFP i114) zebrafish असंक्रमित कान का. मैं neutrophils के आकर्षण नहीं दिखा हैsicle (डॉटेड दीर्घवृत्त) (Leica DFC420C कैमरा के साथ Leica MZ16FA). (एफ) एम. mCherry लेबल तनु E11 :: तमिलनाडु उत्परिवर्ती 17 तनाव eccCb1, marinum बैक्टीरिया पृष्ठदंड में 1 DPF में अंतःक्षिप्त थे. पृष्ठदंड अंदर प्रसार 5 डीपीआई (Leica MZ16FA खुर्दबीन DC500 कैमरा के साथ) में imaged किया गया था. (G) एम. mCherry लेबल लाइन है कि रक्त और लसीका वाहिकाओं के endothelial कोशिकाओं में GFP व्यक्त: marinum E11 बैक्टीरिया टीजी (EGFP fli1a) के 16 सेल चरण zebrafish भ्रूण की जर्दी में अंतःक्षिप्त थे. ग्रेन्युलोमा की तरह पूंछ क्षेत्र में संक्रमित कोशिकाओं के समुच्चय के गठन 5 डीपीआई पर मनाया जाता है (Leica DFC420C कैमरा के साथ Leica MZ16FA माइक्रोस्कोप, 8 से छवि).

Discussion

संक्रमण के इस आलेख में वर्णित तरीकों अक्सर मेजबान सहज रोगक्षमता जीन या बैक्टीरियल विषैलापन जीन ¹ समारोह का अध्ययन किया जाता है. नसों सूक्ष्म इंजेक्शन तरीकों (5 प्रोटोकॉल और 6.1) सबसे अक्सर इस तरह के अध्ययन के लिए उपयोग किया जाता है. पीछे रक्त द्वीप पर दुम का नस 1 दिन पुराने भ्रूण की नसों में इंजेक्शन के लिए सबसे सुविधाजनक स्थान है. दुम का नस और बाद के चरणों में घुसना मुश्किल हो जाता है, हम 2-3 DPF में भ्रूण के लिए अंतःशिरा इंजेक्शन साइट के रूप में कुवियर की वाहिनी पसंद करते हैं. सभी मामलों में यह जीवाणुओं की लगातार संख्या, जो CFU गिनती लिए इंजेक्शन inocula चढ़ाना द्वारा जाँच की जानी चाहिए साथ भ्रूण इंजेक्षन करने के लिए महत्वपूर्ण है. निम्नलिखित पहलुओं प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य इंजेक्शन प्राप्त करने के लिए विचार किया जाना चाहिए. सबसे पहले, यह आवश्यक है के लिए उच्च गुणवत्ता वाले गिलास microcapillary इंजेक्शन सुई है. यदि सुई टिप बहुत बड़ी है, इंजेक्शन घटित खून बह रहा करने के लिए एक पंचर छेद काफी बड़ा बनाने और होगाइंजेक्शन बैक्टीरिया रक्त परिसंचरण के बाहर प्रवाह होगा. दूसरे, बैक्टीरिया रक्त परिसंचरण में सीधे इंजेक्शन चाहिए. यदि सुई टिप नस के अंदर या यदि इंजेक्शन की जर्दी थैली विस्तार में तरल पदार्थ फैलता नहीं है, भ्रूण के प्रयोग से खारिज किया जाना चाहिए. तीसरा, एक कैरियर के रूप में एम. के इंजेक्शन लगाने के लिए PVP40 का उपयोग marinum गिलास सुई में डूब से बैक्टीरिया को रोकने में सहायता करेगा. PVP40 निलंबन की एकरूपता में सुधार, इंजेक्शन की अवधि में और अधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य inocula में जिसके परिणामस्वरूप. PVP40 भी एस के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है typhimurium इंजेक्शन, लेकिन यहाँ यह कम महत्वपूर्ण है क्योंकि बड़े आकार और बैक्टीरिया के उज्ज्वल प्रतिदीप्ति प्रयोगों के दौरान इंजेक्शन inoculum पर एक दृश्य नियंत्रण की अनुमति देता है. हम इंजेक्शन अभ्यास के लिए phenol के लाल डाई (1% v / v) या 1 फ्लोरोसेंट (Invitrogen) अलग अलग रंग में उपलब्ध क्षेत्रों माइक्रोन के उपयोग की सलाह देते हैं. एक बार इस तकनीक में महारत हासिल है, यह लगभग 30 minut लेतातों 50-100 भ्रूण इंजेक्षन करने के लिए agarose प्लेटों पर भ्रूण aligning और बैक्टीरिया इंजेक्शन की मात्रा का समायोजन करने के लिए आवश्यक समय सहित.

जबकि रक्त द्वीप (5 प्रोटोकॉल) में या नसों में इंजेक्शन कुवियर (6.1 प्रोटोकॉल) वाहिनी में सबसे अधिक उपयोग किया जाता है, इस वीडियो लेख में वर्णित संक्रमण की वैकल्पिक मार्गों बृहतभक्षककोशिका और न्युट्रोफिल chemotaxis अध्ययन के लिए उपयोगी (6.2 प्रोटोकॉल, 6.3 साबित कर दिया है , और 6.4), तनु जीवाणु उपभेदों (6.5 प्रोटोकॉल) के विकास का अध्ययन करने के लिए, और उच्च throughput (6.6 प्रोटोकॉल) अनुप्रयोगों ^4-8 के लिए zebrafish संक्रमण मॉडल अनुकूलन. वर्णित सूक्ष्म इंजेक्शन तरीकों वायरस ^{18, 19,} कवक spores ^{14, 20} या प्रोटोजोआ परजीवी (मारिया Forlenza, व्यक्तिगत संचार) के इंजेक्शन के लिए भी लागू किया जा सकता है. इंजेक्शन इस वीडियो लेख में वर्णित प्रक्रियाओं के लिए एक उपयोगी इसके अलावा जीवाणुओं की zebr में चमड़े के नीचे इंजेक्शन के लिए एक हाल ही में वर्णित प्रक्रिया हैभ्रूण afish ^21. इस प्रक्रिया बैक्टीरिया की phagocytosis के न्युट्रोफिल, जो ऊतक सतहों पर कुशलता से निगल जाना बैक्टीरिया पाए गए, लेकिन अध्ययन के लिए लागू किया गया था, मैक्रोफेज करने के लिए इसके विपरीत में, लगभग इंजेक्शन पर रक्त में या तरल पदार्थ से भरे शरीर cavities में बैक्टीरिया phagocytose करने में असमर्थ थे. चमड़े के नीचे इंजेक्शन भ्रूण के लिए पूंछ पेशी इंजेक्शन के लिए इस वीडियो लेख में वर्णित के रूप में इसी तरह तैनात हैं, लेकिन सुई सिर्फ त्वचा के नीचे डाला जाता है विखंड पर बैक्टीरिया इंजेक्षन.

यह महत्वपूर्ण है पर विचार करने के लिए है कि सूक्ष्म इंजेक्शन अनिवार्य रूप से संक्रमण के एक कृत्रिम मार्ग है. हालांकि, जल्दी भ्रूण अत्यधिक बैक्टीरियल रोगज़नक़ों के लिए बाहरी जोखिम के लिए प्रतिरोधी रहे हैं. वास्तव में, जहां भ्रूण एक बैक्टीरियल निलंबन में स्नान कर रहे हैं विसर्जन, assays, ²² हाथों में प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य नहीं हैं. जबकि कुछ भ्रूण विसर्जन पर संक्रमित हो सकते हैं, हम मृत्यु दर में और एक्सप्रेस में एक बड़े बदलाव मनाया हैऐसे assays में व्यक्तिगत भ्रूण के बीच भड़काऊ मार्कर जीन आयन. सूक्ष्म इंजेक्शन इस आलेख में वर्णित तरीकों में प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य संक्रमण प्राप्त करने के लिए और विशेष रूप से मेजबान सहज प्रतिरक्षा कोशिकाओं के साथ बातचीत बैक्टीरिया का अध्ययन करने के लिए उपयोगी होते हैं. एक कुशल व्यक्ति भ्रूण में जीवाणु संक्रमण यों दृष्टिकोण करने के लिए कस्टम, समर्पित पिक्सेल मात्रा का ठहराव ^{17 सॉफ्टवेयर, 23 के} साथ संक्रमित भ्रूण के फ्लोरोसेंट छवियों का विश्लेषण है. इस दृष्टिकोण अच्छी तरह से करने के लिए संक्रमित भ्रूण के चढ़ाना के बाद CFU गिनती के परिणामों के साथ सहसंबंधी दिखाया गया है. इसी प्रकार, भ्रूण प्रति ल्युकोसैट संख्या में रिश्तेदार परिवर्तन ट्रांसजेनिक ल्युकोसैट की fluorophore संवाददाता लाइनों में डिजिटल छवि विश्लेषण के द्वारा मात्रा निर्धारित किया गया है, इस दृष्टिकोण मेजबान ²⁴ संक्रमण के leukopoietic प्रतिक्रिया बढ़ाता लागू होगा.

मेजबान सहज प्रतिरक्षा जीनों के समारोह vivo में कुशलता से किया जा सकता है वर्णित संक्रमण मॉडल के संयोजन के द्वारा जांचmorpholino पछाड़ना के साथ. Morpholinos सिंथेटिक antisense oligonucleotides है कि विशिष्ट RNAs के लक्ष्य और जीन उत्पादों की अभिव्यक्ति को कम जब एक सेल चरण zebrafish भ्रूण में इंजेक्शन के रूप में इस पत्रिका ^{10, 25} में अन्य वीडियो लेख में दिखाया गया हैं. Morpholino पछाड़ना अध्ययन में, यह काफी महत्व की है कि सभी भ्रूण समूहों की तुलना में सही ढंग से मंचन कर रहे हैं जीवाणु इंजेक्शन से पहले. यह विशेष रूप से महत्वपूर्ण है क्योंकि भ्रूण एक विकासशील प्रतिरक्षा प्रणाली है कि तेजी से समय पर सक्षम हो जाता है.

वहाँ कई ट्रांसजेनिक संवाददाता लाइनों वर्तमान प्रमुख सहज प्रतिरक्षा सबसेट, zebrafish भ्रूण में मैक्रोफेज और neutrophils, भेद के लिए उपलब्ध हैं. MPX और lyz प्रमोटरों न्युट्रोफिल रिपोर्टर ^{16 लाइनों, 26, 27} उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया गया है, और csf1r (एफएमएस) और MPEG1 प्रमोटरों बृहतभक्षककोशिका संवाददाताओं से ^{14, 28} का उत्पादन किया गया. जबकि सी.एस.एफ.में 1R (एफएमएस) को अतिरिक्त xanthophores में व्यक्त किया है, MPEG1 अभिव्यक्ति मैक्रोफेज में विशेष रूप है. जैसा कि इस वीडियो लेख में दिखाया गया है, हाल ही में विकसित MPEG1 संवाददाता लाइनों इमेजिंग मैक्रोफेज द्वारा जीवाणु phagocytosis के लिए बहुत उपयोगी हैं.

Materials

Reagent	Supplier	Catalogue number
Phenol Red	Sigma	P0290
Glycerol	Sigma-Aldrich	228210
Difco Middlebrook 7H10 agar	Becton, Dickenson and Company	262710
BBL Middlebrook OADC Enrichment	Becton, Dickenson and Company	211886
Difco Middlebrook 7H9 Broth	Becton, Dickenson and Company	271310
BBL Middlebrook ADC Enrichment	Becton, Dickenson and Company	211887
Tween 80	Sigma-Aldrich	P1754
Polyvinylpyrrolidone (PVP40)	Calbiochem, Merck KGaA	529504
N-Phenylthiourea (PTU)	Sigma-Aldrich	P7629
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (Tricaine)	Sigma-Aldrich	A5040
Methyl cellulose	Sigma-Aldrich	M0387
SeaPlaque Agarose (low melting point agarose)	Lonza Inc.	50100
FluoSpheres (1.0 μm, red fluorescent (580/605))	Invitrogen	F8821
FluoSpheres (1.0 μm, yellow-green fluorescent (505/515))	Invitrogen	F8823