Isolamento de Oligómeros PrP solúveis e insolúveis no cérebro humano normal

Resumo

Uma nova espécie de proteína príon celular (PrP ^C) Foi recentemente identificada em cérebros humanos não infectadas com os métodos descritos aqui. Estes métodos podem ser utilizados para isolar espécies diferentes de PrP, enquanto alguns deles são também úteis no isolamento de outros agregados de proteínas mal dobradas a partir de cérebros humanos.

Resumo

O evento central na patogénese das doenças provocadas por priões envolve a conversão do hospedeiro celular codificado prião proteína PrP ^C em sua isoforma patogénica PrP ^{Sc 1.} PrP ^C é solúvel em detergente e sensível à proteinase K (PK)-digestão, enquanto que a PrP ^Sc detergente forma de agregados insolúveis e é parcialmente resistente a PK ^2-6. A conversão da PrP ^{C e} PrP ^Sc é conhecida por envolver a transição conformacional de α-helicoidal para β folhas estruturas da proteína. No entanto, o caminho em vivo ainda é pouco compreendida. A tentativa endógena ^PrPSc, intermediário * PrP ou "prião silenciosa", ainda tem de ser identificado no cérebro não infectado ^7.

Usando uma combinação de abordagens biofísicas e bioquímicas, identificamos agregados insolúveis PrP ^C (designado iPrP ^C) a partir de cérebros de mamíferos não infectados e em cultura neuronalcélulas ^{8, 9.} Aqui, descrevemos os procedimentos pormenorizados destes métodos, incluindo ultracentrifugação em tampão detergente, a sedimentação em gradiente escalonado de sacarose, cromatografia de exclusão de tamanho, o enriquecimento iPrP pelo gene da proteína 5 (G5p) que se ligam especificamente a formas de PrP estruturalmente alterados ¹⁰ e PK-tratamento. A combinação destas abordagens isolados não apenas insolúvel PrP ^Sc e agregados PrP ^C, mas também oligómeros solúveis PrP ^C a partir do cérebro humano normal. Uma vez que os protocolos aqui descritos foram utilizados para isolar tanto ^PrPSc de cérebros infectados e ^C iPrP de cérebros de não infectados, eles dão-nos a oportunidade de comparar as diferenças nas características físico-químicas, neurotoxicidade e infectividade entre as duas isoformas. Tal estudo vai melhorar muito a nossa compreensão dos agentes infecciosos proteicas. A fisiologia e fisiopatologia do iPrP ^C não são claras no presente. Notavelmente, em recém-iddoença de príon entified humano denominado variável protease-sensível prionopathy, encontramos um novo ^PrPSc que compartilha o comportamento imunorreativos e fragmentação com iPrP ^{C 11, 12.} Além disso, foi recentemente demonstrado que iPrP ^C é a espécie principal, que interage com a proteína amilóide-β na doença de Alzheimer ^13. No mesmo estudo, estes métodos foram usados ​​para isolar os agregados Abeta e oligómeros em doença de Alzheimer, ^13, o que sugere a sua aplicação aos agregados de proteína prião não envolvidos em outras doenças neurodegenerativas.

Protocolo

1. Preparação do homogenato de cérebro e detergente solúvel (S2) e insolúvel (P2) As fracções

1. Tomar 100 mg de tecido cerebral humano congelado e adicionar 100 ul de tampão de lise (10 mM Tris, 150 mM NaCl, 0,5% de Nonidet P-40 (NP-40), EDTA a 0,5%, pH 7,4).
2. Homogeneizar em gelo usando um pilão accionado por um motor sem fios, congelá-lo em gelo seco durante 5 minutos e homogeneizar novamente usando um pilão accionado por mãos primeiro e, em seguida, por motor, e adicionam-se 300 ul de tampão de lise ou 800 ul (isto é, quer o 20 % ou 10% de homogenato de cérebro total, respectivamente).
3. Centrifugar a 20% ou 10% de homogenato de cérebro t....

Discussão

A combinação de abordagens aqui relatado isola consistentemente agregados insolúveis PrP ^C e PrP ^C oligómeros solúveis de cérebro humano normal. Ultracentrifugação a 100.000 xg durante uma hora, é um método clássico que tem sido amplamente utilizado para a separação do insolúvel ^PrPSc solúvel a partir da PrP ^{C 14.} Embora seja eficaz, uma das precauções é evitar a contaminação durante o puxar-se o sobrenadante (S2), após a centrifugação. Uma vez que o perfil de gel de iPrP

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Nome do reagente	Companhia	Número de catálogo	Comentários (opcional)
Fluoreto de fenilmetilsulfonilo	Sigma-Aldrich	P7626	72 mM em 2-propanol
Proteinase K	Sigma-Aldrich	P2308	2 mg / ml em H2O
PNGase F	New England Biolabs	MWGF200
Ultracentrífuga LE-80K, SW55 rotor	Beckman Coulter	Peça n º 365668, 356860
Superdex 200 esferas de RH	GE Healthcare	17-1088-01
AKTA FPLC sistema	GE Healthcare	18-1900-26
Os marcadores de peso molecular	Sigma-Aldrich	MWGF200	Variou
Dynabeads M-280 esferas magnéticas	Invitrogen	143-01
Anticorpo 3F4	Covance	SIG-39600
Anticorpo 1E4	Cell Sciences	M1840
Gel pronto 15% de Tris-HCl géis pré-moldados	Bio-Rad	345-0020