Isolatie van oplosbare en onoplosbare oligomeren in het PrP Normal Human Brain
Summary
Een nieuwe soort cellulaire prion eiwit (PrP<sup> C</sup>) Is onlangs geïdentificeerd in geïnfecteerde menselijke hersenen volgens de methoden beschreven. Deze methoden kunnen worden gebruikt om verschillende PrP soorten te isoleren, terwijl sommige van hen zijn ook bruikbaar bij het isoleren andere misgevouwen proteïneaggregaten uit menselijke hersenen.
Abstract
De centrale gebeurtenis in de pathogenese van prionziekten omvat een omzetting van de gastheer gecodeerde prion eiwit cellulair PrP C in zijn pathogene isovorm PrP Sc 1. PrP C is detergent-oplosbaar en gevoelig voor proteinase K (PK)-spijsvertering, terwijl PrPSc vormt detergent-onoplosbare aggregaten en is gedeeltelijk resistent tegen PK 2-6. De omzetting van PrP C PrP Sc bekend is dat conformationele overgang van α-β naar helix-sheet structuur van het eiwit omvatten. Echter, de in vivo route nog slecht begrepen. Een voorzichtige endogene PrPSc, intermediair PrP * of "stille prion", moet nog worden vastgesteld in de niet-geïnfecteerde hersenen 7.
Met behulp van een combinatie van biofysische en biochemische methoden, we onoplosbare PrP C aggregaten (aangeduid iPrP C) geïdentificeerd van niet-geïnfecteerde zoogdieren hersenen en gekweekte neuronalecellen 8, 9. We beschrijven gedetailleerde procedures van deze methoden, waaronder ultracentrifugatie in detergens buffer, sucrose stapgradiënt sedimentatie, size exclusion chromatografie, iPrP verrijking door gen 5-eiwit (G5p) die specifiek binden aan structureel veranderde PrP vormen 10 en PK-behandeling. De combinatie van deze methoden isolaten niet alleen onoplosbare PrP Sc en PrP C aggregaten ook oplosbare PrP C oligomeren van de normale menselijke hersenen. Aangezien de protocollen hier beschreven zijn gebruikt om zowel PrP Sc isoleren van geïnfecteerde hersenen en iPrP C uit ongeïnfecteerde hersenen, ze ons de mogelijkheid om verschillen in fysisch eigenschappen, neurotoxiciteit, en infectiviteit tussen de twee isovormen vergelijken. Een dergelijk onderzoek zal sterk verbeteren van ons begrip van de besmettelijke eiwitachtige pathogenen. De fysiologie en pathofysiologie van iPrP C zijn onduidelijk op dit moment. Met name in een nieuw identified menselijke prionziekte genoemd variabel protease-gevoelige prionopathy, vonden we een nieuwe PrPSc dat de immunoreactieve gedrag en fragmentatie met iPrP C 11, 12 deelt. Bovendien hebben we recent aangetoond dat iPrP C is de belangrijkste soorten die interageert met amyloid-β-eiwit in Alzheimer disease 13. In dezelfde studie werden deze methoden om Abeta aggregaten en oligomeren isoleren ziekte van Alzheimer 13, suggereert de toepassing ervan niet prion eiwit aggregaten betrokken bij andere neurodegeneratieve aandoeningen.
Protocol
Discussion
De combinatie van benaderingen hier beschreven isolaten vaste onoplosbare aggregaten PrP C en oplosbare oligomeren PrP C van de normale menselijke hersenen. Ultracentrifugatie bij 100.000 xg gedurende een uur is een klassieke methode die veelvuldig gebruikt wordt voor het afscheiden van het onoplosbare PrP Sc van de oplosbare PrP C 14. Hoewel het efficiënt een van de waarschuwingen te voorkomen tijdens het trekken van de supernatant (S2) na centrifugeren. Aangezien de gel pro…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs zijn dank verschuldigd aan het menselijk brein en Spinal Fluid Resource Center (Los Angeles, Californië) voor het verstrekken van normale hersenen monsters. Dit onderzoek werd ondersteund door de National Institutes of Health (NIH) R01NS062787, de CJD Foundation, Alliance biologisch veilig, evenals het Universitair Centrum on Aging en Gezondheid met de steun van de McGregor Foundation en de President's Discretionary Fund (Case Western Reserve University) .
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Phenylmethylsulfonyl fluoride | Sigma-Aldrich | P7626 | 72 mM in 2-propanol |
| Proteinase K | Sigma-Aldrich | P2308 | 2 mg/ml in H2O |
| PNGase F | New England Biolabs | MWGF200 | |
| Ultracentrifuge LE-80K, SW55 rotor | Beckman Coulter | Part No. 365668, 356860 | |
| Superdex 200 HR beads | GE Healthcare | 17-1088-01 | |
| AKTA FPLC system | GE Healthcare | 18-1900-26 | |
| Molecular weight markers | Sigma-Aldrich | MWGF200 | Varied |
| Dynabeads M-280 magnetic beads | Invitrogen | 143-01 | |
| 3F4 antibody | Covance | SIG-39600 | |
| 1E4 antibody | Cell Sciences | M1840 | |
| Ready gel 15% Tris-HCl pre-cast gels | Bio-Rad | 345-0020 |
Referências
- Prusiner, S. B. Prions. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95, 13363-13383 (1998).
- Oesch, B., Westaway, D., Wälchli, M., McKinley, M. P., Kent, S. B. H., Aebersold, R., Barry, R. A., Tempst, P., Teplow, D. B., Hood, L. E., Prusiner, S. B., Weissmann, C. A cellular gene encodes scrapie PrP 27-30 protein. Cell. 40, 735-746 (1985).
- Bolton, D. C., McKinley, M. P., Prusiner, S. B. Identification of a protein that purifies with the scrapie prion. Science. 218, 1309-1311 (1982).
- Prusiner, S. B., McKinley, M. P., Bowman, K. A., Bolton, D. C., Bendheim, P. E., Groth, D. F., Glenner, G. G. Scrapie prions aggregate to form amyloid-like birefringent rods. Cell. 35, 349-358 (1983).
- Hope, J., Morton, L. J., Farquhar, C. F., Multhaup, G., Beyreuther, K., Kimberlin, R. H. The major polypeptide of scrapie-associated fibrils (SAF) has the same size, charge distribution and N-terminal protein sequence as predicted for the normal brain protein (PrP). EMBO J. 5, 2591-2597 (1986).
- Prusiner, S. B., Groth, D. F., Bolton, D. C., Kent, S. B., Hood, L. E. Purification and structural studies of a major scrapie prion protein. Cell. 38, 127-134 (1984).
- Hall, D., Edskes, H. Silent prions lying in wait: a two-hit model of prion/amyloid formation and infection. J. Mol. Biol. 336, 775-786 (2004).
- Yuan, J., Xiao, X., McGeehan, J., Dong, Z., Cali, I., Fujioka, H., Kong, Q., Kneale, G., Gambetti, P., Zou, W. Q. Insoluble aggregates and protease-resistant conformers of prion protein in uninfected human brains. J. Biol. Chem. 281, 34848-34858 (2006).
- Yuan, J., Dong, Z., Guo, J. P., McGeehan, J., Xiao, X., Wang, J., Cali, I., McGeer, P. L., Cashman, N. R., Bessen, R., Surewicz, W. K., Kneale, G., Petersen, R. B., Gambetti, P., Zou, W. Q. Accessibility of a critical prion protein region involved in strain recognition and its implications for the early detection of prions. Cell. Mol. Life Sci. 65, 631-643 (2008).
- Zou, W. Q., Zheng, J., Gray, D. M., Gambetti, P., Chen, S. G. Antibody to DNA detects scrapie but not normal prion protein. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 1380-1385 (2004).
- Gambetti, P., Dong, Z., Yuan, J., Xiao, X., Zheng, M., Alshekhlee, A., Castellani, R., Cohen, M., Barria, M. A., Gonzalez-Romero, D., Belay, E. D., Schonberger, L. B., Marder, K., Harris, C. A novel human disease with abnormal prion protein sensitive to protease. Ann. Neurol. 63, 697-708 (2008).
- Zou, W. Q., Puoti, G., Xiao, X., Yuan, J., Qing, L., Cali, I., Shimoji, M., Langeveld, J. P., Castellani, R., Notari, S., Crain, B., Schmidt, R. E., Geschwind, M. Variably protease-sensitive prionopathy: A new sporadic disease of the prion protein. Ann. Neurol. 68, 162-172 (2010).
- Zou, W. Q., Xiao, X., Yuan, J., Puoti, G., Fujioka, H., Wang, X., Richardson, S., Zhou, X., Zou, R., Li, S., Zhu, X. Amyloid-beta42 interacts mainly with insoluble prion protein in the Alzheimer brain. J. Biol. Chem. 286, 15095-15105 (2011).
- Zou, W. Q., Colucci, M., Gambetti, P., Chen, S. G., Potter, N. T. Characterization of prion proteins. Methods in Molecular Biology-Neurogenetics: Methods and Protocols. , 305-314 (2002).
- Tzaban, S., Friedlander, G., Schonberger, O., Horonchik, L., Yedidia, Y., Shaked, G., Gabizon, R., Taraboulos, A. Protease-sensitive scrapie prion protein in aggregates of heterogeneous sizes. Bioquímica. 41, 12868-12875 (2002).
