Isolement des oligomères de PrP solubles et insolubles dans le cerveau humain normal
Summary
Une nouvelle espèce de protéine prion cellulaire (PrP<sup> C</sup>) A été récemment identifié dans les cerveaux humains non infectés en utilisant les méthodes décrites ici. Ces méthodes peuvent être utilisées pour isoler des espèces différentes PrP, alors que certains d'entre eux sont également utile pour isoler des agrégats de protéines mal repliées autres à partir de cerveaux humains.
Abstract
L'événement central dans la pathogenèse des maladies à prions implique une conversion de l'codée par l'hôte cellulaire protéine prion PrP C dans son isoforme pathogène PrPSc 1. PrP C est soluble dans un détergent et sensible à la protéinase K (PK)-digestion, alors que la PrP Sc forme détergent insolubles dans les granulats et est partiellement résistante à la PK 2-6. La conversion de la PrP C et PrP Sc est connu d'associer une transition conformationnelle de α-hélicoïdale de β-feuille structures de la protéine. Cependant, la voie en vivo est encore mal comprise. Une tentative endogène PrP Sc, intermédiaire PrP * ou «prion silencieuse», n'a pas encore été identifié dans le cerveau infecté 7.
En utilisant une combinaison d'approches biophysiques et biochimiques, nous avons identifié insolubles PrP C (agrégats désigné IPRP C) à partir de cerveau des mammifères non infectés et mis en culture neuronale8, 9 cellules. Ici, nous décrivons les procédures détaillées de ces méthodes, y compris ultracentrifugation dans un tampon de détergent, de la sédimentation sur gradient de saccharose étape, chromatographie d'exclusion stérique, l'enrichissement IPRP par la protéine du gène 5 (G5p) qui se lient spécifiquement à des formes de PrP structurellement modifiés 10 et PK-traitement. La combinaison de ces approches isole non seulement insoluble PrP Sc et agrégats de PrP C, mais aussi solubles PrP C oligomères du cerveau humain normal. Étant donné que les protocoles décrits ici ont été utilisés pour isoler les deux PrP Sc de cerveaux infectés et le RPIB C à partir de cerveaux sains, ils nous donnent l'occasion de comparer les différences dans les caractéristiques physico-chimiques, neurotoxicité, et l'infectivité entre les deux isoformes. Une telle étude permettra d'améliorer grandement notre compréhension des agents pathogènes infectieux protéiniques. La physiologie et la physiopathologie des IPRP C ne sont pas claires à l'heure actuelle. Notamment, dans un nouveau-identified maladies humaines à prion appelée variable sensible à une protéase prionopathy, nous avons trouvé une nouvelle PrP Sc qui partage le comportement immunologique et la fragmentation des IPRP C 11, 12. En outre, nous avons récemment démontré que IPRP C est la principale espèce qui interagit avec la protéine amyloïde β-dans la maladie d'Alzheimer 13. Dans la même étude, ces méthodes ont été utilisées pour isoler des agrégats et des oligomères Abeta dans la maladie d'Alzheimer 13, ce qui suggère leur application aux agrégats de protéines prion non impliqués dans d'autres maladies neurodégénératives.
Protocol
Discussion
La combinaison des approches présentées ici isole toujours insolubles PrP C et agrégats solubles PrP C oligomères du cerveau humain normal. Ultracentrifugation à 100.000 xg pendant une heure est une méthode classique qui a été largement utilisé pour la séparation de l'insoluble PrP Sc de la PrP C soluble 14. Bien qu'il soit efficace, l'une des mises en garde est d'éviter la contamination lors du tirage du surnageant (S2) après centrifugat…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
La auteurs tiennent à remercier le cerveau humain et de la moelle Centre de ressources fluide (Los Angeles, CA) pour fournir des échantillons de cerveaux normaux. Cette étude a été financée par le National Institutes of Health (NIH) R01NS062787, la Fondation de la MCJ, Alliance BioSecure, ainsi que le Centre de l'Université sur le vieillissement et la santé, avec le soutien de la Fondation McGregor et Fonds discrétionnaire du Président (Case Western Reserve University) .
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Phenylmethylsulfonyl fluoride | Sigma-Aldrich | P7626 | 72 mM in 2-propanol |
| Proteinase K | Sigma-Aldrich | P2308 | 2 mg/ml in H2O |
| PNGase F | New England Biolabs | MWGF200 | |
| Ultracentrifuge LE-80K, SW55 rotor | Beckman Coulter | Part No. 365668, 356860 | |
| Superdex 200 HR beads | GE Healthcare | 17-1088-01 | |
| AKTA FPLC system | GE Healthcare | 18-1900-26 | |
| Molecular weight markers | Sigma-Aldrich | MWGF200 | Varied |
| Dynabeads M-280 magnetic beads | Invitrogen | 143-01 | |
| 3F4 antibody | Covance | SIG-39600 | |
| 1E4 antibody | Cell Sciences | M1840 | |
| Ready gel 15% Tris-HCl pre-cast gels | Bio-Rad | 345-0020 |
Referências
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