בידוד של oligomers PRP המסיס ובלתי מסיס במוח האנושי הרגיל
Summary
זן חדש של חלבון פריון תאי (PRP<sup> C</sup>) לאחרונה זוהה במוחות האנושיים נגועים באמצעות שיטות שתוארו כאן. שיטות אלה יכולים לשמש לבודד מיני PRP שונים, וחלק מהם שימושי גם בבידוד אגרגטים חלבון misfolded אחרים ממוחות אנושיים.
Abstract
האירוע המרכזי בפתוגנזה של מחלות Prion כרוך המרה של חלבון הפריון התאי PRP C מארח בקידוד לפתוגניים איזופורם PRP 1 Sc. PRP C היא מסיסה בחומרי ניקוי ורגיש לproteinase K (קי)-עיכול, ואילו PRP Sc יוצר אגרגטים חומרי ניקוי מסיסים ובחלקה עמידה לקי 2-6. המרה של PRP C כדי PRP Sc ידוע כרוכה מעבר קונפורמציה של סליל α למבני β מאזניות של החלבון. עם זאת, במסלול vivo הוא עדיין ממעטים להבין. אנדוגני PRP Sc מהוסס, * ביניים PRP או "פריונים שקטים", טרם זוהה במוח הנגוע 7.
באמצעות שילוב של גישות biophysical וביוכימיים, זיהו אגרגטים C מסיסים PRP (המיועד iPrP C) ממוח יונקים נגועים ותרבית עצביתתאים 8, 9. כאן, אנו מתארים את תהליכים מפורטים של שיטות אלה, כוללים ultracentrifugation במאגר חומרי ניקוי, שקיעה הדרגתית צעד סוכרוז, כרומטוגרפיה הדרת גודל, העשרת iPrP ב 5 חלבון הגן (g5p) כי דווקא להיקשר לצורות מבניות שינו PRP 10 ו-PK טיפול. שילוב של גישות אלה מבודד לא רק PRP PRP אגרגטים C oligomers C המסיס PRP מהמוח האנושי הרגיל Sc המסיס וגם. מאז את הפרוטוקולים מתוארים כאן שמשו לבודד שני PRP Sc ממוחות נגועים וiPrP C ממוחה נגוע, הם מספקים לנו הזדמנות להשוות הבדלים בתכונות physicochemical, רעילות עצבית, וinfectivity בין שני isoforms. מחקר כזה ישפר מאוד את ההבנה של פתוגנים חלבוניים זיהומיות שלנו. הפיסיולוגיה ופתופיזיולוגיה של iPrP C אינם ברורים כרגע. יש לציין, שבזה עתה idמחלות פריונים אנושיות entified כינו variably פרוטאז הרגיש prionopathy, מצא PRP Sc חדש שהוא בעל ההתנהגות ופיצול immunoreactive עם iPrP 11 ג, 12. יתר על כן, לאחרונה הראה כי iPrP C היא המינים העיקריים המקיימים אינטראקציה עם חלבון עמילואיד-β באלצהיימר 13. באותו המחקר, שיטות אלה שמשו לבודד אגרגטים וoligomers Abeta במחלת אלצהיימר 13, המצביע על היישום שלהם לאגרגטים חלבון אינם פריונים המעורבים בהפרעות ניווניות אחרות.
Protocol
Discussion
שילוב של גישות דיווח כאן מבודד אגרגטים עקביות מסיסים PRP C וoligomers המסיס PRP C מהמוח האנושי הרגיל. Ultracentrifugation ב100.000 XG במשך שעה אחת הוא שיטה קלסית שכבר בשימוש נרחב להפרדת PRP Sc המסיס מPRP C המסיס 14. אמנם זה יעיל, אחד הוא מזהיר כדי למנוע זיהום במהלך מו?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מחברים מודים למוח האנושי ומרכז משאבי נוזל שדרה (לוס אנג'לס, קליפורניה) למתן דגימות מוח נורמליות. מחקר זה נתמך על ידי המכון הלאומי לבריאות (NIH) R01NS062787, CJD קרן אליאנס BioSecure, כמו גם את המרכז האוניברסיטאי להזדקנות ובריאות בתמיכת מקגרגור הקרן והקרן לפי שיקול הדעת של הנשיא (אוניברסיטת Case Western Reserve) .
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Phenylmethylsulfonyl fluoride | Sigma-Aldrich | P7626 | 72 mM in 2-propanol |
| Proteinase K | Sigma-Aldrich | P2308 | 2 mg/ml in H2O |
| PNGase F | New England Biolabs | MWGF200 | |
| Ultracentrifuge LE-80K, SW55 rotor | Beckman Coulter | Part No. 365668, 356860 | |
| Superdex 200 HR beads | GE Healthcare | 17-1088-01 | |
| AKTA FPLC system | GE Healthcare | 18-1900-26 | |
| Molecular weight markers | Sigma-Aldrich | MWGF200 | Varied |
| Dynabeads M-280 magnetic beads | Invitrogen | 143-01 | |
| 3F4 antibody | Covance | SIG-39600 | |
| 1E4 antibody | Cell Sciences | M1840 | |
| Ready gel 15% Tris-HCl pre-cast gels | Bio-Rad | 345-0020 |
Referências
- Prusiner, S. B. Prions. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95, 13363-13383 (1998).
- Oesch, B., Westaway, D., Wälchli, M., McKinley, M. P., Kent, S. B. H., Aebersold, R., Barry, R. A., Tempst, P., Teplow, D. B., Hood, L. E., Prusiner, S. B., Weissmann, C. A cellular gene encodes scrapie PrP 27-30 protein. Cell. 40, 735-746 (1985).
- Bolton, D. C., McKinley, M. P., Prusiner, S. B. Identification of a protein that purifies with the scrapie prion. Science. 218, 1309-1311 (1982).
- Prusiner, S. B., McKinley, M. P., Bowman, K. A., Bolton, D. C., Bendheim, P. E., Groth, D. F., Glenner, G. G. Scrapie prions aggregate to form amyloid-like birefringent rods. Cell. 35, 349-358 (1983).
- Hope, J., Morton, L. J., Farquhar, C. F., Multhaup, G., Beyreuther, K., Kimberlin, R. H. The major polypeptide of scrapie-associated fibrils (SAF) has the same size, charge distribution and N-terminal protein sequence as predicted for the normal brain protein (PrP). EMBO J. 5, 2591-2597 (1986).
- Prusiner, S. B., Groth, D. F., Bolton, D. C., Kent, S. B., Hood, L. E. Purification and structural studies of a major scrapie prion protein. Cell. 38, 127-134 (1984).
- Hall, D., Edskes, H. Silent prions lying in wait: a two-hit model of prion/amyloid formation and infection. J. Mol. Biol. 336, 775-786 (2004).
- Yuan, J., Xiao, X., McGeehan, J., Dong, Z., Cali, I., Fujioka, H., Kong, Q., Kneale, G., Gambetti, P., Zou, W. Q. Insoluble aggregates and protease-resistant conformers of prion protein in uninfected human brains. J. Biol. Chem. 281, 34848-34858 (2006).
- Yuan, J., Dong, Z., Guo, J. P., McGeehan, J., Xiao, X., Wang, J., Cali, I., McGeer, P. L., Cashman, N. R., Bessen, R., Surewicz, W. K., Kneale, G., Petersen, R. B., Gambetti, P., Zou, W. Q. Accessibility of a critical prion protein region involved in strain recognition and its implications for the early detection of prions. Cell. Mol. Life Sci. 65, 631-643 (2008).
- Zou, W. Q., Zheng, J., Gray, D. M., Gambetti, P., Chen, S. G. Antibody to DNA detects scrapie but not normal prion protein. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 1380-1385 (2004).
- Gambetti, P., Dong, Z., Yuan, J., Xiao, X., Zheng, M., Alshekhlee, A., Castellani, R., Cohen, M., Barria, M. A., Gonzalez-Romero, D., Belay, E. D., Schonberger, L. B., Marder, K., Harris, C. A novel human disease with abnormal prion protein sensitive to protease. Ann. Neurol. 63, 697-708 (2008).
- Zou, W. Q., Puoti, G., Xiao, X., Yuan, J., Qing, L., Cali, I., Shimoji, M., Langeveld, J. P., Castellani, R., Notari, S., Crain, B., Schmidt, R. E., Geschwind, M. Variably protease-sensitive prionopathy: A new sporadic disease of the prion protein. Ann. Neurol. 68, 162-172 (2010).
- Zou, W. Q., Xiao, X., Yuan, J., Puoti, G., Fujioka, H., Wang, X., Richardson, S., Zhou, X., Zou, R., Li, S., Zhu, X. Amyloid-beta42 interacts mainly with insoluble prion protein in the Alzheimer brain. J. Biol. Chem. 286, 15095-15105 (2011).
- Zou, W. Q., Colucci, M., Gambetti, P., Chen, S. G., Potter, N. T. Characterization of prion proteins. Methods in Molecular Biology-Neurogenetics: Methods and Protocols. , 305-314 (2002).
- Tzaban, S., Friedlander, G., Schonberger, O., Horonchik, L., Yedidia, Y., Shaked, G., Gabizon, R., Taraboulos, A. Protease-sensitive scrapie prion protein in aggregates of heterogeneous sizes. Bioquímica. 41, 12868-12875 (2002).
