正常なヒト脳内の可溶性および不溶性のPrPオリゴマーの分離
Summary
細胞プリオンタンパク質の新種（PRP<sup> C</sup>）は最近、ここで説明する方法を使用して、感染していない人間の脳で確認されています。そのうちのいくつかはまた、人間の脳から他のミスフォールドしたタンパク質凝集体を単離するのに有用であるが、これらの方法は、様々な種のPrPを単離することができる。
Abstract
プリオン病の病因において中心的なイベントには、その病原性のイソ型の PrP Sc 1にホストでエンコードされた細胞プリオンタンパク質PrP Cをの変換を伴う。 PrP Sc は界面活性剤不溶性の凝集体を形成し、PKの2月6日に部分的に耐性であるのに対し、PrP Cのは 、界面活性剤可溶性およびプロテイナーゼK（PK）消化に敏感です。 PrP ScのためにPRP Cの変換はタンパク質のβシート構造へのα-ヘリックスの構造転移を伴うことが知られている。しかし、in vivo経路でまだよくわかっていない。暫定的な内因性のPrP Scは、中間のPrP *または"サイレントプリオン"は、感染していない脳7で特定されていない。
生物物理学的および生化学的なアプローチの組み合わせを使用して、我々は感染していない哺乳動物の脳や神経細胞培養から不溶性のPrP Cの集計（指定IPRP C）が同定されセル8,9。ここでは、洗剤液、スクロースステップ勾配沈降、サイズ排除クロマトグラフィー、具体的には、構造的に変更されたPrPのフォーム10とPK-治療にバインド遺伝子5タンパク質（g5p）によるIPRP濃縮度の超遠心分離を含め、これらの方法の詳細な手順を説明します。これらの方法の組み合わせで不溶性の PrP ScとPrP Cの集合体でなく、通常の人間の脳からの可溶性PrP Cのオリゴマーだけを分離します。ここに記載されているプロトコルは、感染していない脳から感染した脳からの PrP ScとIPRP Cの両方を分離するために使用されているので、それらは物理化学的特徴、神経毒性、そして二つのアイソフォーム間で感染性の違いを比較する機会を提供してくれる。そのような研究は大幅に感染性病原体のタンパク質性の我々の理解を向上させます。 IPRP Cの生理および病態生理学は、現時点では不明である。特に、新たに-idのentifiedヒトプリオン病はプロテアーゼ感受性prionopathy可変と呼ばれる、私たちはIPRP C 11、12と免疫反応挙動およびフラグメンテーションを共有する新しいPrP Sc を発見した。また、我々は最近、IPRP Cがアルツハイマー病13のアミロイドβタンパク質と相互作用する主要な種であることを実証した。同じ研究では、これらのメソッドは、他の神経変性疾患に関与する非プリオンタンパク質の凝集体への応用を示唆し、アルツハイマー病13安部田集合体およびオリゴマーを分離するために使用されていました。
Protocol
Discussion
ここで報告アプローチの組み合わせは、通常の人間の脳から一貫して不溶性のPrP Cの集合体と水溶性のPrP Cのオリゴマーを分離します。 1時間100,000×gで遠心分離は広く水溶性PrP Cが14から不溶性のPrP Scの分離のために使用されてきた古典的な方法です。それが効率的ですが、注意事項の一つは、遠心分離後の上澄み液（S2）を引っ張る時の汚染を避けるためです?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ザ 著者らは、正常な脳のサンプルを提供するための人間の脳と脊髄液リソースセンター（ロサンゼルス、カリフォルニア州）に感謝しています。この研究は、マクレガー財団の支援や、大統領の裁量基金（ケース·ウェスタン·リザーブ大学）と米国立衛生研究所（NIH）R01NS062787、CJD財団、アライアンスBioSecure、ならびに大学の老化センターと健康によってサポートされていました。
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Phenylmethylsulfonyl fluoride | Sigma-Aldrich | P7626 | 72 mM in 2-propanol |
| Proteinase K | Sigma-Aldrich | P2308 | 2 mg/ml in H2O |
| PNGase F | New England Biolabs | MWGF200 | |
| Ultracentrifuge LE-80K, SW55 rotor | Beckman Coulter | Part No. 365668, 356860 | |
| Superdex 200 HR beads | GE Healthcare | 17-1088-01 | |
| AKTA FPLC system | GE Healthcare | 18-1900-26 | |
| Molecular weight markers | Sigma-Aldrich | MWGF200 | Varied |
| Dynabeads M-280 magnetic beads | Invitrogen | 143-01 | |
| 3F4 antibody | Covance | SIG-39600 | |
| 1E4 antibody | Cell Sciences | M1840 | |
| Ready gel 15% Tris-HCl pre-cast gels | Bio-Rad | 345-0020 |
Referências
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