في Electroporation OVO في شبكية العين الفرخ الجنينية
Summary
الهدف العام من هذا الفيديو هو إظهار كيفية تنفيذ حقن الشبكية المستهدفة و<em> في البيضة</em> electroporation من الحمض النووي / الحمض النووي الريبي يبني في شبكية العين كتكوت الجنينية في هامبورغ وهاملتون مرحلة 22-23، وهي عبارة عن يوم الجنينية 4 (E4). هذه التقنية مفيدة جدا لدراسة التعبير الجيني، تنظيم الجينات، والتغيير الصرفي في تطوير شبكية العين الفرخ.
Abstract
شبكية العين الدجاج الجنينية هو أداة ممتازة لدراسة تطوير شبكية العين في الفقاريات العليا. بسبب الحجم الكبير والتنمية الخارجية، فمن السهل جدا نسبيا لمعالجة شبكية العين كتكوت الجنينية باستخدام المؤتلف DNA / RNA التكنولوجيا. Electroporation من الحمض النووي / الحمض النووي الريبي في البنى الشبكية الجنينية تتمتع بميزة كبيرة لدراسة تنظيم الجينات في الخلايا الجذعية / السلف في شبكية العين خلال تطوير شبكية العين. لا يمكن أن يؤديها نوع مختلف من فحوصات مثل فحص الجينات المراسل، جين الافراط في التعبير، والجينات بهدم (shRNA) وما إلى ذلك باستخدام تقنية electroporation. هذا الفيديو يشرح حقن في شبكية العين، واستهدفت في electroporation البيضة في شبكية العين كتكوت الجنينية في هامبورغ وهاملتون مرحلة 22-23، وهي عبارة عن يوم الجنينية 4 (E4). هنا نعرض سريعة ومريحة في تقنية electroporation البيضة حيث يتم تسليمها مباشرة البلازميد التي تعبر عن بروتين الفلورية الخضراء (GFP) كعلامة فيكتكوت الجنينية الفضاء تحت الشبكية وتليها نبضات كهربائية لتسهيل امتصاص الحمض النووي عن طريق الخلايا الجذعية / السلف في شبكية العين. طريقة جديدة للحقن في شبكية العين وelectroporation في E4 يسمح التصور من جميع أنواع الخلايا في شبكية العين، بما في ذلك الخلايا العصبية في وقت متأخر من مواليد 1، والتي كان من الصعب مع الأسلوب التقليدي للحقن وelectroporation في E1.5 2.
Protocol
Discussion
استهدفت حقن في شبكية العين وelectroporation البيضة في شبكية العين في المرحلة الجنينية E4 يمكن أن تستهدف على وجه التحديد الخلايا الاصلية في شبكية العين مما يؤدي إلى القدرة على تصور كل خلية شبكية العين 6 أنواع رئيسية على مستوى خلية واحدة. في electroporation البيضة في HH10 (…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نود أن نشكر السيد معاذ أنور لاستخدام كاميرا HD له (كانون VIXIA HFS100). وأيد هذا العمل في جزء من المنح المقدمة من المعاهد الوطنية للصحة (EY018738)، نيو جيرسي جنة البحوث الحبل الشوكي (08-3074-SCR-E-0 و 10-3091-SCR-0-E)، وبوش جائزة بحوث الطبية الحيوية.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Fertilized pathogen-free (SPF) white leghorn chicken eggs | Sunrise Farms (Catskill, NY) | ||
| Chicken egg incubator | GQF manufacturing, Savannah, GA | Model-1550 | Set to 60% humidity and 37.5°C. |
| Glass capillary tubes | World Precision Instrument Inc. | TW150F-4 | |
| 0.1 ml syringe | Hamilton Co. Reno, Nevada | Gastight 1710 | Alternatively 1ml syringe can be used as well |
| Masterflex Silicone (peroxide) Tubing | Cole-Parmer | HV-96400-13 | Cut a small piece (1 cm) for attaching the glass needle to the syringe |
| Tweezers | Dumont | AA | |
| Micromanipulator | World Precision Instrument Inc. | M3301-M3 | |
| Plasmid DNA | pCAG-GFP was borrowed from Dr. Connie Cepko | ||
| Fast Green FCF | Sigma-Aldrich | F7252 | Dilute it to 0.025 % with PBS |
| Pulse generator | Harvard Apparatus, MA | BTX ECM 830 | Square wave generator |
| Electrodes | Harvard Apparatus, MA | BTX model 514 | Our electrodes were spaced 3-5 mm apart |
| Monochrome Digital Camera | Zeiss, Germany | Axiocam MRM | |
| Fluorescent Dissection Microscope | Leica Microsystems, Germany | Leica MZ16FA | |
| Upright Fluorescence Microscope | Zeiss, Germany | Zeiss Axio Imager A1 |
References
- Doh, S. T. Analysis of retinal cell development in chick embryo by immunohistochemistry and in ovo electroporation techniques. BMC. Dev. Biol. 10, (2010).
- Blank, M. C., Chizhikov, V., Millen, K. J. In Ovo Electroporations of HH Stage 10 Chicken Embryos. J. Vis. Exp. (9), e408-e408 (2007).
- Nakamura, H., Funahashi, J. Introduction of DNA into chick embryos by in ovo electroporation. Methods. 24, 43-48 (2001).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. 1951. Dev. Dyn.. 195, 231-272 (1992).
- Hamburger, V. The stage series of the chick embryo. Dev. Dyn. 195, 273-275 (1992).
