Encelliga Mätning av dopaminfrisättning med samtidig Spänning-klämma och amperometri
Summary
Den amperometriska tekniken mäter dopaminfrisättning från en enda cell genom att detektera den oxidativa ström som produceras av spontan dopamin oxidation. Samtidig spänning klämma och amperometri metodik avslöjar mekanistiska förhållandet mellan den totala "aktivitet" av dopamin transportören och reglerande roll denna aktivitet på baksidan transport av dopamin.
Abstract
Efter dess release i synaptiska klyftan, dopamin utövar sina biologiska egenskaper via sina pre-och postsynaptiska mål 1. Dopamin signalen avslutas genom diffusion 2-3, extracellulära enzymer 4 och transportörer membran 5. Dopamin transportör, som ligger i den peri-synaptiska klyftan av dopaminneuroner rensar de frigjorda aminer genom en inre dopamin flöde (upptag). Den dopamintransportörer kan också arbeta i motsatt riktning för att frigöra aminer från insidan till utsidan på en process som kallas yttre transport eller utflöde av dopamin 5. . Mer än 20 år sedan Sulzer et al rapporterade dopamin transportören kan arbeta i två lägen Verksamhetsområde: framåt (upptag) och omvänd (efflux) 5. Signalsubstansen frigörs via utflöde genom transportören kan flytta en stor mängd dopamin till det extracellulära utrymmet, och har visat sig spela en viktig reglerande roll i extracellulärt dopamin timomeostasis 6. Här beskriver vi hur samtidig patch clamp och amperometri inspelning kan användas för att mäta ut dopamin via effluxmekanism med millisekunders tidsupplösning när membranpotentialen styrs. För detta är hel-cell nuvarande och oxidativ (amperometriska) signaler mätas samtidigt med en Axopatch 200B förstärkare (Molecular Devices, med en låg-pass Besselfiltrets inställd på 1.000 Hz för helcell-aktuell inspelning). För amperometri inspelning en elektrod kolfiber är ansluten till en andra förstärkare (Axopatch 200B) och är placerad intill plasmamembranet och hölls vid 700 mV. De hel-cell-och oxidativ (amperometriska) strömmar kan registreras och ström-spänning relation kan genereras med hjälp av en spänning steg protokoll. Till skillnad från den vanliga amperometriska kalibrering, vilket kräver omvandling till koncentration, visas den aktuella redovisas direkt utan hänsyn till faktiska volymen 7. Således resulterande datautgör en undre gräns till dopamin utflöde eftersom vissa sändaren förlorade mot bulklösningen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Samtidig spänning-klämma och amperometri har följande fördelar. Alla celltyper är tillgängliga och kan användas för inspelning. Identifieringen av cellerna eller neuron där inspelningarna görs är enkel och okomplicerad. I synnerhet, om cellen är fluorescensmärkta genom tillsats av en fluorescerande markör till proteinet av intresse försöksledaren kan enkelt välja målcellen eller neuron. Den experimentella utformningen medger jämn och kontrollerad tillförsel av farmakologiska medel antingen via fläck…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar Dr Sanika Chirwa för kritisk granskning av detta manuskript. Detta arbete stöddes av National Institutes of Health (DA026947, DA021471 och NS071122).
Materials
| Equipment | |||
| Anti-vibration table w/faraday cage | Technical Manufacturing Corporation | 63-500 series | we use model 63-543 |
| Inverted microscope Nikon TE-2000 | Nikon | discontinued | now Eclipse Ti |
| Two low noise amplifiers axopatch 200b | Molecular Devices | 800-635-5577 | |
| 1-CV 203 BU headstage | Molecular Devices | 800-635-5578 | |
| 1-HL-U pipette holder | Molecular Devices | 800-635-5579 | |
| Digidata 1440A A/D converter | Molecular Devices | 800-635-5580 | |
| Two manipulators Siskyou, left and right handed | Siskiyou | MX6600R MX6600L | 877-313-6418 |
| Laser pipette puller | Sutter Instruments | P-2000 | 888-883-0128 |
| Low noise carbon fiber amperometric electrode | ProCFE | www.dagan.com | |
| Low noise quartz pipette | Sutter Instruments | QF100-70-7.5 | 888-883-0128 |
| 12-volt car battery | widely available | ||
| Car battery charger | widely available | ||
| Reagent | |||
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma | S7653 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| Dextrose | Sigma | G7528 | |
| Magnesium sulfate (MgSO4) | Sigma | M2643 | |
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Sigma | P5655 | |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma | P9333 | |
| Calcium chloride dihydrate (CaCl2•2H20) | Sigma | 223506 | |
| Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2•6H20) | Sigma | M2670 | |
| EGTA | Sigma | E0396 |
Referências
- Michael, A. C., Ikeda, M., Justice, J. B. Mechanisms contributing to the recovery of striatal releasable dopamine following MFB stimulation. Brain Res. 421, 325-335 (1987).
- Gonon, F. Prolonged and extrasynaptic excitatory action of dopamine mediated by D1 receptors in the rat striatum in vivo. J. Neurosci. 17, 5972-5978 (1997).
- Sulzer, D., Pothos, E. N. Regulation of quantal size by presynaptic mechanisms. Rev. Neurosci. 11, 159-212 (2000).
- Napolitano, A., Cesura, A. M., Da Prada, M. The role of monoamine oxidase and catechol O-methyltransferase in dopaminergic neurotransmission. J. Neural. Transm. Suppl. 45, 35-45 (1995).
- Sulzer, D., Maidment, N. T., Rayport, S. Amphetamine and other weak bases act to promote reverse transport of dopamine in ventral midbrain neurons. J. Neurochem. 60, 527-535 (1993).
- Salahpour, A., et al. Increased amphetamine-induced hyperactivity and reward in mice overexpressing the dopamine transporter. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 4405-4410 (2008).
- Khoshbouei, H., Wang, H., Lechleiter, J. D., Javitch, J. A., Galli, A. Amphetamine-induced dopamine efflux. A voltage-sensitive and intracellular Na+-dependent mechanism. J. Biol. Chem. 278, 12070-12077 (2003).
- Goodwin, J. S., et al. Amphetamine and methamphetamine differentially affect dopamine transporters in vitro and in. , 284-2978 (2009).
- Kahlig, K. M., et al. Amphetamine induces dopamine efflux through a dopamine transporter channel. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 3495-3500 (2005).
- Swant, J., Chirwa, S., Stanwood, G., Khoshbouei, H. Methamphetamine reduces LTP and increases baseline synaptic transmission in the CA1 region of mouse hippocampus. PLoS One. 5, e11382 (2010).
- Gnegy, M. E., et al. Intracellular Ca2+ regulates amphetamine-induced dopamine efflux and currents mediated by the human dopamine transporter. Mol. Pharmacol. 66, 137-143 (2004).
