我们描述了一停流仪器的使用调查还原和氧化半反应<em>曲霉</em>一个铁载体(SIDA),黄素依赖型单加氧酶。然后,我们显示相应的在思达反应的物种的光谱,并计算其形成的速率常数。
曲霉一个铁载体(SIDA)是一个基金会含有单加氧酶催化合成氧肟酸铁载体,是重要的毒力(如ferricrocin或N',N“,N”' – triacetylfusarinine丙类)1氨酸羟化。由思达催化反应可以分为还原和氧化半反应(图1),在还原半反应,氧化基金会绑定到一个F思达,减少NADPH的2,3。在氧化半反应,减少辅反应与氧分子,形成一个C4A-hydroperoxyflavin中间,其中一个氧原子转移到鸟。在这里,我们描述了一个程序来衡量利率和检测思达不同光谱形式安装在仪器使用停流厌氧手套箱。在停流仪器,小体积的反应物迅速混合,后日停止流通的ë停止注射器( 图1),在观察细胞中的解决方案的光谱变化随着时间的推移记录。在实验的第一部分,我们将展示我们如何可以使用单一的模式,直接测量黄素NADPH的一个F思达厌氧减少停流仪器。然后,我们使用双混合设置一个F思达第一厌氧NADPH的减少,老龄化循环期间在指定的时间,然后在观察细胞( 图1)氧分子的反应。为了执行这个实验中,厌氧缓冲区是必要的,因为只有还原半反应监测时,任何解决方案中的氧气反应会减少的黄素辅,并形成一个C4A-hydroperoxyflavin中间,最终会衰变成氧化黄素。这不会使用户能够准确地测量削减率自会有完成营业额的ENZyme。当氧化半反应正在研究的酶必须在缺氧的情况下减少之间的氧化还原的步骤,以便观察。在这个实验中所使用的缓冲区之一是饱和的氧气,使我们可以研究在高浓度的氧气氧化半反应。这些通常的程序进行了研究含黄素的单加氧酶或氧化还原半反应时。停止流进行预稳态实验的时间尺度是秒毫秒,这让内在的速率常数的测定和反应中间体的检测和鉴定。这里所描述的程序,可以应用于其他黄素依赖型单加氧酶5,6。
酶催化氧化还原反应通常含有如血红素和黄素显着的吸光度的变化发生在催化循环的辅助因子。黄素氧化的形式呈现在〜360和450 nm的吸收最大值,它的减少通常在7 450纳米以下的吸收减少监测。在一般情况下,一些短暂的中间体存在,但形式和衰变太快,要定期分光光度计测量。使用应用光物理SX20的停流分光光度计(或类似的工具),它是可以在毫秒时间尺度来衡量的吸光度变化(死区时间,2毫秒)。在这里,我们研究的黄素依赖型单加氧酶的F思达和氧化还原半反应,作为一个模型。氢转移速率决定通过测量与NADPH酶在厌氧条件下混合后在452 nm处的吸光度变化。随后,采取advantagE,酶的双模式混合停流仪器与NADPH反应,直到实现全面减少,减少的酶,辅酶+复杂与氧气混合。在此过程中,它是可以检测瞬态含氧的黄素中间体的形成和衰变率来衡量。这些中间体的鉴定提供了在催化反应物种的性质有关的实验数据。在一个F思达,C4A-hydroperoxyflavin(通常在370-380 nm的监测),这是羟基化物种的形成。此外,每一步的速率常数测量可以获取有关速率决定步骤的反应信息,并有助于阐明酶的动力学和化学机制。
在一般情况下,类似的方法可用于的其他flavoenzymes,或变化发生其中吸收的蛋白质,如蛋白质,是续AIN血红素,哆磷酸盐,非血红素铁8-10。对这种方法的局限性,需要大量纯化的酶,但是这可以通过使用高产量表达系统来克服。一个决定最佳录音谱蛋白浓度,用足够的蛋白质,所以可以观察到一个足够强的信号,但不是太多,使酶不被浪费。通常情况下,停流实验中使用的含黄素酶的酶浓度最低的是6-10微米(混合后),并确定使用相应的酶的摩尔消光系数。在一个F思达的情况下,酶的约束基金会的比例是50-65%2。 APO-蛋白被视为在这些实验中无效,因为绑定的FAD辅基催化是必要的。这种方法的另一个可能的限制是如果在酶的过程发生的速度比2毫秒(停止流动的死区时间),他们不会被观察到,但日ERE报告利率可以下降到解决这一问题的策略。这种情况的一个例子,包括使用高NaCl浓度在1铁氧还蛋白-NADP +还原酶11反应。停止流流电路的氧气擦洗往往是一个棘手的一步,在这个实验中,需要特别注意。这里描述的葡萄糖氧化酶,葡萄糖系统在大多数实验室中成功地使用,因为它是一个有效和廉价的方法。然而,也有一些缺点,其中包括对H 2 O 2的生产,并作为protocatechuate-protocatechuate双加氧酶系统的其他替代品,对于某些应用,应考虑12。利用厌氧手套箱,使得它更容易确保厌氧条件下,但并非是必不可少的。我们希望酶在缺氧的情况下减少或与氧气发生反应,在浓度,氧气必须从停止流流电路那就是我们指定。虽然停流是在手套箱,有流电路中的氧气,如果我们在以前的实验中使用的有氧缓冲区。吸光度测量此外,荧光和圆二色检测可以在应用光物理SX20的停流分光光度计进行相应的配件。
The authors have nothing to disclose.
研究支持NSF奖断路器-1021384。
General Laboratory Equipment | Company | Catalogue Number |
Vacuum pump | Welch | – |
Büchner flasks | Fisher | 70340-500 |
Stir bars | Fisher | 14-512-129 |
Stir plates | Fisher | 11-100-49S |
Schlenk lines | Kontes Glass | – |
Argon tank | Airgas | AR UPC300 |
Nitrogen tank | Airgas | NI200 |
Nitrogen tank, ultra high purity grade | Airgas | NI UHP200 |
Oxygen tank | Airgas | OX 40 |
5% Hydrogen balance nitrogen tank | Airgas | X02NI95B200H998 |
SX20 Stopped-flow spectrophotometer | AppliedPhotophysics | – |
Glove box | Coy | – |
Water bath | Brinkmann Lauda | – |
Supplies | ||
50 mL BD Falcon tubes | Fisher | 14-432-23 |
15 mL BD Falcon conical tubes | Fisher | 05-527-90 |
1.5 mL Eppendorf microcentrifuge tubes | Fisher | 05-402-18 |
50 and 25 mL glass vials | Fisher | 06-402 |
Rubber stoppers | Fisher | 06-447H |
Aluminum seals | Fisher | 06-406-15 |
Reagents | ||
Potassium phosphate, monobasic | Fisher | AC2714080025 |
Potassium phosphate, dibasic | Fisher | P288-500 |
Sodium acetate | Sigma | S-2889 |
Glucose oxidase from A. niger | Sigma | G7141-250KU |
D-Glucose | Fisher | D16-500 |
β-NADPH | Fisher | ICN10116783 |
L(+)-Ornithine hydrochloride | Fisher | ICN10116783 |