Reprogramação de células somáticas humanas em células tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) usando vetor retroviral com GFP

Summary

Um método para gerar células tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) através de expressão retrovírus mediada ectópica de Oct4, SOX2, KLF4 e MYC é descrito. Uma maneira prática de identificar humanos colônias de IPSC com base na expressão de GFP também é discutida.

Abstract

Células estaminais embrionárias humanas (hESCs) são pluripotentes e uma fonte de valor inestimável para celulares in vitro de modelagem de doenças e medicina regenerativa ^1. Já foi demonstrado que as células somáticas humanas pode ser reprogramado para pluripotência pela expressão ectópica dos quatro fatores de transcrição (Oct4, Sox2, KLF4 e Myc) e tornar-se células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) ^2-4. Como hESCs, iPSCs humanas são pluripotentes e uma fonte potencial de células autólogas. Aqui nós descrevemos o protocolo de reprogramar células de fibroblastos humanos, com os quatro fatores de reprogramação clonados em GFP contendo backbone retroviral ^4. Usando o protocolo seguinte, geramos iPSCs humanos em 3-4 semanas sob condições de cultura humana ESC. Colónias humanos IPSC se assemelham hESCs na morfologia e exibir a perda de fluorescência da GFP como um resultado de silenciamento do transgene retroviral. IPSC colônias isoladas mecanicamente sob microscopia de fluorescênciaep comportar-se de uma maneira semelhante à hESCs. Nestas células, nós detectar a expressão de vários genes pluripotência e marcadores de superfície.

Protocol

1. Reprogramação por retrovírus Expressando Fatores Reprogramação Fibroblastos humanos são cultivados em meio de fibroblastos (10% de FBS em meio DMEM com Pen / Strep). Um dia antes da infecção, placa de 1×10 5 fibroblastos humanos em um poço de uma placa de 6 poços. Aspirar meio para remover células mortas e adicionar 2 ml de meio de fibroblastos fresco. Adicionar sulfato de protamina, na concentração final de 5 ug / ml. Adicionar cuidadosamente a quantid…

Discussion

Expressão de quatro fatores de transcrição reprograma fibroblastos humanos para iPSCs. Muitas tentativas foram feitas para gerar iPSCs humanos utilizando abordagens não integradoras ou não-genética para gerar iPSCs clinicamente seguros. Até agora, esses métodos mostram eficiência extremamente baixa e exigem otimização para melhorar a reprodutibilidade ^11-14. Métodos de retro-ou lentiviral são prontamente utilizados para obter e aplicar iPSCs para o homem em modelos de doenças <…

Materials

Name	Concentration	Company	Catalogue Number
hESC medium
DMEM/F12	80%	Invitrogen	11330057
Knockout Serum Replacer	20%	Invitrogen	10828-028
L-Glutamine (200 mM)	2 mM	Invitrogen	25030081
Nonessential Amino Acids (10 mM)	0.1 mM	Invitrogen	11140050
β-Mercaptoethanol (14.3 M) or MTG	0.1 mM	Invitrogen	M-6250
bFGF-2 10 μg/ml	4 ng/ml	GIBCO/BRL	GF003AF
Penicillin/Streptomycin	1%	Millipore	15140-122
Fiboblasts Medium
DMEM	90%	Invitrogen	11965118
FBS	10%	Invitrogen	10407028
Penicillin/Streptomycin	1%	Millipore	15140-122

Table 1. Culture Medium

Name	Concentration	Company	Catalogue Number
Antibodies
OCT4	1:500	Abcam	Ab19857
SSEA3	1:100	Milipore	MAB4303
SSEA4	1:100	BD Biosciences	BD560218
Tra-1-81	1:100	BD Biosciences	BD560173
Tra-1-60	1:100	BD Biosciences	BD560174
NANOG	1:500	Abcam	Ab21624
Alexa-Flur 488	1:1000	Invitrogen	A11008
Alexa-Flur 555	1:1000	Invitrogen	A21422
DAPI	1:5000	Invitrogen	D1306
Plasmids
pMIG-OCT4		Addgene	17225
pMIG-SOX2		Addgene	17226
pMIG-KLF4		Addgene	17227
pMIG-MYC		Addgene	18119
Other Materials
Collagenase type IV	1mg/ml	Invitrogen	17104019
Gelatin, Porcine	0.1%	Sigma	G 1890
Triton	0.2%	Sigma	X100-500ML
Paraformaldehyde	4%	Sigma	47608
BSA	3%	American Bioanalytical	AB01800
MEF feeder cells		Millipore	PMEF-N
Cell Lifter		Corning	3008
Equipment
Fluorescent microscopy: inverted microscope with GFP filter

Table 2. Reagents and equipment.