Surveillance en temps réel des interactions ligand-récepteur avec Fluorescence Resonance Energy Transfer
Summary
On démontre FRET entre le polymère conjugué polydiacétylène (PDA) et un fluorophore attaché à la surface des liposomes PDA pour la détection de biomolécules. Liposomes PDA contient également des molécules réceptrices sur leurs surfaces de biomolécules à être utilisées en tant que sondes. Interactions ligand-récepteur entraîner des changements dans l'efficacité de FRET entre le fluorophore et PDA qui est la base du mécanisme de détection.
Abstract
FRET est un processus par lequel l'énergie est non-radiative transféré d'une molécule donneur excité à une molécule accepteur de l'état fondamental par le biais longue portée interactions dipôle-dipôle 1. Dans le présent essai de détection, nous utilisons une propriété intéressante de PDA: bleu-décalage du spectre d'absorption UV-Vis électronique de PDA (figure 1) après un analyte interagit avec les récepteurs attachés aux PDA 2,3,4,7. Ce changement dans le spectre d'absorption PDA prévoit des changements dans le recouvrement spectral (J) entre PDA (accepteur) et la rhodamine (bailleurs de fonds) qui conduit à des changements dans l'efficacité de FRET. Ainsi, les interactions entre l'analyte (ligand) et les récepteurs sont détectés par FRET entre fluorophores donneurs et les PDA. En particulier, nous montrons la détection d'une molécule de streptavidine protéine modèle. Nous démontrons également la liaison covalente d'albumine sérique bovine (BSA) à la surface du liposome avec mécanisme de FRET. Ces interactions entre til liposomes bicouches et des molécules protéiques peuvent être détectés en temps réel. La méthode proposée est une méthode générale de détection chimique petites et grandes molécules biochimiques. Depuis la fluorescence est intrinsèquement plus sensibles que la colorimétrie, la limite de détection du test peut être en Afrique sub-nanomolaire plage ou moins 8. En outre, un PDA peut agir comme un accepteur de FRET universel, ce qui signifie que plusieurs capteurs peuvent être mis au point avec un PDA (accepteur) fonctionnalisé avec donneurs et des récepteurs différents attachés à la surface des liposomes PDA.
Protocol
Discussion
Nous avons effectué la liaison sélective des résidus lysine de la protéine à la surface des liposomes en utilisant NHS-amine réaction. Cette méthode basée sur FRET est capable de faire le suivi en temps réel de la biotine-streptavidine et de protéines (BSA) se liant à la surface du liposome. Procédure similaire peut être appliquée à l'étude de la dynamique de liaison des interactions entre protéines différentes avec leurs récepteurs sélectifs. Il est souplesse dans le choix des fluorophores qui f…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Le soutien financier pour ce travail a été fournie par la National Science Foundation, le National Institute of Health (NIH), la technologie des matériaux Center (MTC) et l'ORDA à SIUC. Nous remercions la NSF pour une subvention (CHE-0959568) pour l'achat d'un FE-SEM. Nous tenons à remercier le professeur Matthew McCarroll pour des discussions utiles. Julia Reyes tiens à remercier COLCIENCIAS, Agence colombienne et l'Universidad Pedagogica y Tecnológica de la Colombie pour son érudition et de soutien financier.
Materials
| Name of reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| 10,12-pentacosadiynoic acid (PCDA) | GFS chemicals | 3261 | Light sensitive |
| N-hydroxysuccinimide (NHS) | Acros organics | 157270250 | Moisture sensitive |
| 1-(3-(dimethylamino)propyl)-3-ethylcarbodiimide hydrochloride (EDC) | Chem-impex International | 00050 | |
| 1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DMPC) | Avanti Polar lipids | 850345P | |
| Rhodamine-tagged Bovine Serum Albumin (BSA-Rh) | Sigma Aldrich | A4537 | |
| (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(biotinyl)(biotin-DOPE) | Avanti Polar lipids | 870282 |
Referências
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