Мониторинг в реальном времени лиганд-рецепторных взаимодействий с флуоресцентной резонансного переноса энергии
Summary
Мы демонстрируем FRET между сопряженными полидиацетилена полимера (PDA) и флуорофор прикреплены к поверхности липосом для PDA зондирования биомолекул. PDA липосомы также содержатся молекулы-рецепторы на своей поверхности для биомолекул, которые будут использоваться в качестве зондов. Лиганд-рецепторного взаимодействия приводят к изменениям в эффективности FRET между флуорофором и КПК, который является основой чувствительный механизм.
Abstract
FRET является процесс, при котором энергия не является радиационно передается от возбужденной молекулы донора основного состояния молекулы акцептора через дальний диполь-дипольных взаимодействий 1. В настоящее зондирования анализа, мы используем одно интересное свойство PDA: синий сдвиг в UV-Vis электронном спектре поглощения КПК (рис. 1) после аналита взаимодействует с рецепторами прикреплены к PDA 2,3,4,7. Этот сдвиг в спектре поглощения PDA обеспечивает изменения спектрального перекрытия (J) между КПК (акцептор) и родамина (донора), что приводит к изменениям в FRET эффективности. Таким образом, взаимодействие между аналита (лигандов) и рецепторы обнаружены с помощью FRET между донором флуорофоров и КПК. В частности, мы показываем зондирования молекулы белка стрептавидина модели. Мы также демонстрируют ковалентной привязки бычьего сывороточного альбумина (БСА) в липосомы поверхность с FRET механизм. Эти взаимодействия между тОн бислой липосом и молекул белка может быть воспринято в режиме реального времени. Предлагаемый метод является общим методом для измерения небольших химических и биохимических больших молекул. С флуоресценции является принципиально более чувствительны, чем колориметрии, предел обнаружения анализ может быть в суб-наномолярных диапазоне или ниже 8. Кроме того, КПК может выступать в качестве универсального акцептора в FRET, что означает, что несколько датчиков могут быть разработаны с КПК (акцептор) функционализированные с донорами и различные рецепторы прикреплены к поверхности липосом PDA.
Protocol
Discussion
Мы провели избирательного связывания остатка лизина белка на поверхности липосомы использованием NHS-амин реакции. Это FRET метода, основанного на это способна в режиме реального времени мониторинг биотин-стрептавидина и белка (БСА) привязку к поверхности липосомы. Подобная процедура мо…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Финансовая поддержка для этой работы была предоставлена через Национальный научный фонд, Национальный институт здоровья (NIH), материалы технический центр (MTC) и ОРДА в SIUC. Мы благодарим NSF на получение гранта (CHE-0959568) на приобретение FE-SEM. Мы хотели бы поблагодарить профессора Мэтью McCarroll за полезные обсуждения. Юлия Рейес хотел бы поблагодарить COLCIENCIAS, Колумбийский университет агентства и Pedagogica у Tecnologica Колумбии за ее стипендии и финансовую поддержку.
Materials
| Name of reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| 10,12-pentacosadiynoic acid (PCDA) | GFS chemicals | 3261 | Light sensitive |
| N-hydroxysuccinimide (NHS) | Acros organics | 157270250 | Moisture sensitive |
| 1-(3-(dimethylamino)propyl)-3-ethylcarbodiimide hydrochloride (EDC) | Chem-impex International | 00050 | |
| 1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DMPC) | Avanti Polar lipids | 850345P | |
| Rhodamine-tagged Bovine Serum Albumin (BSA-Rh) | Sigma Aldrich | A4537 | |
| (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(biotinyl)(biotin-DOPE) | Avanti Polar lipids | 870282 |
Referências
- Lakowicz, J. R. . Principles of Fluorescence Spectroscopy. , (1999).
- Charych, D. H., Nagy, J. O., Spevak, W., Bednarski, M. D. Direct Colorimetric Detection of a Receptor-Ligand Interaction by a Polymerized Bilayer Assembly. Science. 261, 585-588 (1993).
- Yoon, B., Lee, S., Kim, J. -. M. Recent Conceptual and Technological Advances in Polydiacetylene-based Supramolecular Chemosensors. Chem. Soc. Rev. 38, 1958-1968 (2009).
- Xuelian, L. i., Kohli, P. u. n. i. t. Investigating Molecular Interactions in Biosensors Based on Fluorescence Resonance Energy Transfer. J. Phys. Chem. C. 114, 6255-6264 (2010).
- Li, X., Matthews, S., Kohli, P. Fluorescence Resonance Energy Transfer in Polydiacetylene Liposomes. J. Phys. Chem. B. 112, 13263-13272 (2008).
- Li, X., McCarroll, M., Kohli, P. Modulating Fluorescence Resonance Energy Transfer in Conjugated Liposomes. Langmuir. 22, (2006).
- New, R. R. C., New, R. R. C. . Liposomes: A Practical Approach. , 33-104 (1990).
- Chen, X., Lee, J., Jou, M. J., Kim, J. -. M., Yoon, J. Colorimetric and Fluorometric Detection of Cationic Surfactants Based on Conjugated Polydiacetylene Supramolecules. Chem. Commun. , 3434-3436 (2009).
- Yarimaga, O., Im, M., Choi, Y. -. K., Kim, T. W., Jung, Y. K., Park, H. G., Lee, S., Kim, J. -. M. A Color Display System Based on Thermochromic Conjugated Polydiacetylene. Macromolecular Research. 18, 404-407 (2010).
