En genetisk skærm for at isolere Toxoplasma gondii Host-celle afstigningstrin Mutants

Summary

Forward genetik er en stærk metode til at optrævle det molekylære niveau af, hvordan<em> Toxoplasma</em> Egresses fra værtscellen. Protokoller er tilvejebragt til kemisk mutagenisere parasitter, berige for mutanter med defekter i induceret udgang, og validere fænotypen af ​​klonede mutanter.

Abstract

Den udbredte, obligat intracellulær, protozoparasit Toxoplasma gondii forårsager opportunistisk sygdom i immunsvækkede patienter og forårsager fødselsdefekter på medfødt infektion. Den lytiske replikationscyklus er karakteriseret ved tre faser: 1. aktiv invasion af en nukleeret værtscelle; 2. replikation inde i værtscellen; 3. aktive udgang fra værtscellen. Mekanismen for udstrømning i stigende grad værdsat som en unik, stærkt reguleret proces, som er stadig dårligt forstået på det molekylære niveau. De signalveje ligger til grund for udgang har været karakteriseret ved brug af farmakologiske midler, der virker på forskellige aspekter af de veje ^1-5. Som sådan har flere uafhængige udløser udgang blevet identificeret som alle konvergerer på frigivelsen af intracellulære ^{Ca2 +,} et signal, som også er kritisk for værtscellen invasion ^6-8. Denne indsigt oplyste en kandidat gen, tilgang, som førte til identifikationring af anlæg som calcium-afhængig proteinkinase (CDPK) er involveret i udgang ^9. Desuden har flere nylige gennembrud i forståelsen udgang er foretaget ved hjælp af (kemisk) genetiske tilgange ^10-12. At kombinere det væld af farmakologiske oplysninger med den stigende genetiske tilgængeligheden af Toxoplasma vi for nylig nedsat en skærm gør det muligt for berigelse for parasittens mutanter med en defekt i værtscellen udgang ^13. Selv kemisk mutagenese med N-ethyl-N-nitrosourinstof (ENU) eller ethylmethansulfonat (EMS) er blevet anvendt i årtier i studiet af Toxoplasma biologi ^11,14,15, først for nylig har genetisk kortlægning af mutationer ligger fænotyperne blevet rutine ^{16 -18.} Endvidere, ved at generere temperaturfølsomme mutanter, kan vigtige processer udskæres og de underliggende generne identificeres direkte. Disse mutanter opfører sig som vildtype under permissive temperatur (35 ° C), men undlader at proliferate ved den restriktive temperatur (40 ° C) som følge af mutation i spørgsmål. Her viser vi en ny fænotypisk screening fremgangsmåde til at isolere mutanter med en temperaturfølsom fænotype udgang ^13. Udfordringen for udgangs skærme er at adskille egressed fra ikke-egressed parasitter, som kompliceres af hurtig re-invasion og generel klæbrighed af parasitterne til værtscellerne. En tidligere etablerede udgang skærm er baseret på en besværlig række biotinyleringsbetingelserne trin til at adskille intracellulær fra ekstracellulære parasitter ^11. Denne fremgangsmåde heller ikke generere betingede mutanter deraf i svage fænotyper. Den her beskrevne fremgangsmåde overvinder den stærke binding af træder ud parasitter ved at inkludere en glycan konkurrent, dextransulfat (DS), der forhindrer parasitter i at klæbe til værtscellen ^19. Desuden er ekstracellulære parasitter specifikt dræbt ved pyrrolidin dithiocarbamat (PDTC), hvilket efterlader intracellulære parasitteruskadt ^20. Derfor, med en ny fænotypisk skærm til specifikt at isolere parasit mutanter med defekter i induceret udgang, kan kraften i genetik nu udnyttes fuldt ud at udrede de molekylære mekanismer, der ligger værtscellen udgang.

Protocol

Oversigt Protokoller er tilvejebragt først at definere den dosis af mutagen fører til en 70% drab af parasitter (protokol 1). Den næste procedure til berige inducerede udgangs-mutanter fra en mutageniseret parasit pool (protokol nr. 2, figur 2). Dette efterfølges af en protokol til at teste forekomsten af ​​udgangs mutanter i den berigede pool eller validere udgang fænotype i individuelle mutanter (protokol 3). Endelig er en protokol, forudsat at generere en enkelt parasit kloner fra b…

Discussion

Den beskrevne protokol giver en effektiv metode til at isolere Toxoplasma mutanter med en udgang defekt. Vi har med held isoleret mutanter langs forskellige trin udgangsventilen pathway, hvoraf nogle har en dobbelt invasion fænotype ^13. Potentielle virkninger på invasion kan bestemmes ved hjælp af den såkaldte rød-grønne analyse, som adskiller invaderede fra ikke-invaderet parasitter ved forskellen antistoffarvning ^23,24. For både invasion og afstigning assays kan det være be…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments
ENU	Sigma-Aldrich	N3385	1 M Stock in DMSO, store at -20°C
EMS	Sigma-Aldrich	M0880	1 M Stock in DMSO, store at -20°C
Dextran Sulfate	Sigma-Aldrich	D4911
PDTC	Sigma-Aldrich	P8765	100 mM Stock in PBS
Diff Quick	EMD Chemicals	65044-93
Filter holder	Cole-Parmer	540100
3 μm polycarbonate filter	Whatman Schleicher & Schuell	110612
Hemocytometer	Hausser Scientific	1475
CO2 incubators	Various manufacturers		Humidified, 5% CO2, at 35, 37 and 40°C
Fluorescence microscope	Various manufacturers		Ideally inverted, wide-field with 63x or 100x oil objective

HBSSc (according to Black et al.¹¹):

• 98.0 ml Hanks Balanced Salt Solution (Hyclone catalog number SH30588)
• 100 μl 1M MgCl₂ (100 mM end)
• 100 μl 1M CaCl₂ (100 mM end)
• 2.0 ml 1M Hepes pH 7.3 (20 mM end)
• 84 mg NaHCO₃ (10 mM end)