Una pantalla genética para aislar Toxoplasma gondii Célula huésped-mutantes Egress

Summary

Adelante la genética es un poderoso método para desentrañar el nivel molecular de cómo<em> Toxoplasma</em> Egresados ​​de su célula huésped. Protocolos se proporcionan para mutagenizar químicamente parásitos, enriquecer a los mutantes con defectos en la salida inducida, y validar el fenotipo de los mutantes clonados.

Abstract

La generalizada, intracelular obligado, protozoo parásito Toxoplasma gondii causa la enfermedad oportunista en pacientes inmunocomprometidos y causa defectos de nacimiento después de la infección congénita. El ciclo de replicación lítica se caracteriza por tres etapas: 1. invasión activa de una célula huésped nucleada; 2. replicación dentro de la célula huésped; 3. salida activa de la célula huésped. El mecanismo de salida está cada vez más apreciado como un proceso único, altamente regulado, lo que aún es poco conocido a nivel molecular. Las vías de señalización que subyacen salida se han caracterizado mediante el uso de agentes farmacológicos que actúan sobre los diferentes aspectos de las vías de ^1-5. En este sentido, varios disparadores independientes de egreso se han identificado que todos convergen en la liberación de Ca ^{2 +} intracelular, una señal de que también es crítico para la invasión de la célula huésped ^6-8. Esta visión informó a un enfoque de genes candidatos que llevó a la identificacióncación de la planta como el calcio de la proteína quinasa dependiente (CDPK) que participan en salida ^9. Además, varios avances recientes en la comprensión de salida se han realizado utilizando (química) los enfoques genéticos ^10-12. Para combinar la riqueza de la información farmacológica con el aumento de la accesibilidad genética de Toxoplasma hemos establecido una pantalla que permite el enriquecimiento de los parásitos mutantes con un defecto en la salida de la célula huésped ^13. Aunque mutagénesis química utilizando N-etil-N-nitrosourea (ENU) o metanosulfonato de etilo (EMS) se ha utilizado durante décadas en el estudio de la biología Toxoplasma ^11,14,15, sólo recientemente se ha mapeo genético de las mutaciones que subyacen a los fenotipos convertido en una rutina ^{16 -18.} Por otra parte, mediante la generación de mutantes sensibles a la temperatura, los procesos esenciales pueden ser analizados y los genes subyacentes identificados directamente. Estos mutantes se comportan como de tipo salvaje en la temperatura permisiva (35 º C), pero no proliferate a la temperatura restrictiva (40 ° C) como un resultado de la mutación en cuestión. Aquí se ilustra un nuevo método de cribado fenotípico para aislar mutantes con un fenotipo sensible a la temperatura de salida ^13. El reto para las pantallas de egreso es separar egresados ​​de la no-egresados ​​parásitos, lo cual es complicado por la rápida re-invasión y la rigidez general de los parásitos de las células anfitrionas. Una pantalla de salida previamente establecida se basa en una serie de pasos engorrosos biotinilación para separar intracelular de parásitos extracelulares ^11. Este método también no generar mutantes condicionales resultan en fenotipos débiles. El método descrito aquí supera la fuerte adhesión de egressing parásitos mediante la inclusión de un competidor glicano, sulfato de dextrano (DS), que impide que los parásitos se pegue a la célula huésped ^19. Por otra parte, los parásitos extracelulares son específicamente exterminados por pirrolidina ditiocarbamato (PDTC), lo que deja los parásitos intracelularessanos y salvos ^20. Por lo tanto, con una nueva pantalla fenotípica para aislar específicamente mutantes con defectos en el parásito de salida inducida por el poder de la genética ahora se puede estar totalmente desplegado para desentrañar los mecanismos moleculares subyacentes de salida de la célula huésped.

Protocol

Información general Protocolos se proporcionan para definir primero la dosificación de la mutágeno que conduce a una matanza 70% de los parásitos (protocolo 1). El siguiente procedimiento se ofrece para enriquecer los mutantes inducidos por el egreso de un grupo mutagenizado parásito (el protocolo 2, Figura 2). Esto es seguido por un protocolo para probar la incidencia de los mutantes de egreso en la piscina enriquecido, o para validar el fenotipo de salida en los mutantes individuales (pr…

Discussion

El protocolo descrito proporciona un método eficiente para aislar mutantes Toxoplasma con un defecto de salida. Hemos aislado con éxito mutantes a lo largo de diversas etapas de la vía de salida, algunos de los cuales tienen un fenotipo invasión de doble ^13. Los efectos potenciales sobre la invasión se puede determinar utilizando el llamado ensayo de rojo-verde, que distingue invadido de no invadido por parásitos tinción diferencial anticuerpo ^23,24. Para ambos ensayos de inva…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments
ENU	Sigma-Aldrich	N3385	1 M Stock in DMSO, store at -20°C
EMS	Sigma-Aldrich	M0880	1 M Stock in DMSO, store at -20°C
Dextran Sulfate	Sigma-Aldrich	D4911
PDTC	Sigma-Aldrich	P8765	100 mM Stock in PBS
Diff Quick	EMD Chemicals	65044-93
Filter holder	Cole-Parmer	540100
3 μm polycarbonate filter	Whatman Schleicher & Schuell	110612
Hemocytometer	Hausser Scientific	1475
CO2 incubators	Various manufacturers		Humidified, 5% CO2, at 35, 37 and 40°C
Fluorescence microscope	Various manufacturers		Ideally inverted, wide-field with 63x or 100x oil objective

HBSSc (according to Black et al.¹¹):

• 98.0 ml Hanks Balanced Salt Solution (Hyclone catalog number SH30588)
• 100 μl 1M MgCl₂ (100 mM end)
• 100 μl 1M CaCl₂ (100 mM end)
• 2.0 ml 1M Hepes pH 7.3 (20 mM end)
• 84 mg NaHCO₃ (10 mM end)