Ein genetischer Screen zu isolieren Toxoplasma gondii Host-Zelle Egress Mutanten

Summary

Vorwärts Genetik ist eine leistungsfähige Methode, um die molekularen Ebene, wie entwirren<em> Toxoplasma</em> Austritt aus der Wirtszelle. Protokolle werden bereitgestellt, um chemisch mutagenisieren Parasiten, bereichern nach Mutanten mit Defekten in der induzierten Egress und Validierung der Phänotyp der Mutanten geklont.

Abstract

Die weit verbreitete, obligat intrazelluläre, einzelligen Parasiten Toxoplasma gondii verursacht opportunistische Erkrankung bei immungeschwächten Patienten und verursacht Missbildungen bei kongenitaler Infektion. 1: Die lytischen Replikationszyklus wird durch drei Phasen gekennzeichnet. aktive Invasion eines kernhaltigen Wirtszelle; 2. Replikation in der Wirtszelle; 3. aktive Austritt aus der Wirtszelle. Der Mechanismus des Austritts wird zunehmend als eine einzigartige, stark regulierten Prozess, der immer noch schlecht ist auf molekularer Ebene zu verstehen, zu schätzen. Die zugrunde liegenden Ausgangs-Signalwege sind durch die Verwendung von pharmakologischen Mitteln, die auf verschiedene Aspekte der Wege ^1-5 gekennzeichnet. Als solches, mehrere unabhängige Auslöser Austritts identifiziert worden, die alle auf die Freisetzung von intrazellulärem Ca ^{2 +} konvergieren, ein Signal, das ebenfalls kritisch ist für die Host-Invasion ^6-8. Diese Einsicht teilte ein Kandidatengen-Ansatz, der auf die identi geführtFIZIERUNG der Pflanze wie Kalzium abhängige Proteinkinase (CDPK) in Egress ⁹ beteiligt. Darüber hinaus haben mehrere neuere Durchbrüche im Verständnis Egress gemacht worden mit (chemischen) genetische Ansätze ^12.10. Um die Fülle an Informationen pharmakologische mit der zunehmenden Verfügbarkeit von genetischen Toxoplasma kombinieren wir vor kurzem ein Bildschirm erlaubt die Anreicherung für Parasiten Mutanten mit einem Defekt in der Wirtszelle Egress ^13. Obwohl chemische Mutagenese mit N-Ethyl-N-nitrosoharnstoff (ENU) oder Ethylmethansulfonat (EMS) wird seit Jahrzehnten in der Studie von Toxoplasma Biologie ^11,14,15 verwendet worden, erst vor kurzem hat genetische Kartierung von Mutationen zugrunde liegen, die Phänotypen zur Routine geworden ^{16 -18.} Ferner kann durch Erzeugen temperaturempfindlichen Mutanten können essentielle Verfahren präpariert und die zugrunde liegenden Genen direkt identifiziert. Diese Mutanten verhalten, als Wild-Typ unter der permissiven Temperatur (35 ° C), aber nicht zu proliferate bei der restriktiven Temperatur (40 ° C) als Ergebnis der Mutation in Frage. Hier zeigen eine neue phänotypische Screening-Verfahren, um Mutanten mit einem temperaturempfindlichen Austritts-Phänotyp ¹³ zu isolieren. Die Herausforderung für die Ausgangs-Bildschirmen ist es, aus Nicht-egressed Parasiten, die durch schnelle Re-Invasion und die allgemeine Klebrigkeit der Parasiten zu Wirtszellen kompliziert ist egressed trennen. Ein vorher festgelegten Ausstieg Bildschirm wurde auf einer Reihe von umständlichen Biotinylierung Schritte zur Trennung von extrazellulären Parasiten ¹¹ intrazellulären basiert. Auch diese Methode nicht erzeugen bedingte Mutanten was zu schwachen Phänotypen. Das hier beschriebene Verfahren überwindet die starke Bindung von Parasiten austritt, indem ein Glykan Konkurrenten, Dextransulfat (DS), die Parasiten verhindert das Anhaften von dem Host-Zelle ^19. Darüber hinaus sind extrazelluläre Parasiten speziell durch Pyrrolidin (PDTC), die intrazelluläre Parasiten verlässt getötet²⁰ unverletzt. Deshalb mit einem neuen phänotypischen Bildschirm, um gezielt zu isolieren Parasit Mutanten mit Defekten in induzierter Egress, kann die Kraft der Genetik nun voll eingesetzt werden, um die molekularen Mechanismen der Wirtszelle Egress entwirren.

Protocol

Überblick Protokolle sind vorgesehen, um zunächst den Dosierung des Mutagen was zu einer 70% igen Abtötung der Parasiten (Protokoll 1). Im nächsten Verfahren wird bereitgestellt, um die induzierten Mutanten Austritt aus einer mutagenisierten Parasit Pool (Protokoll 2, Abbildung 2) zu bereichern. Dies wird durch ein Protokoll, um die Inzidenz von Austritts-Mutanten, die in dem angereicherten Pool zu testen, oder um den Austritt Phänotyp in den einzelnen Mutanten (Protokoll 3) validieren gef…

Discussion

Die beschriebene Protokoll stellt eine effiziente Methode zur Toxoplasma Mutanten mit einer Austritts-Defekt zu isolieren. Wir haben erfolgreich Mutanten auf verschiedenen Stufen des Austritts Bahn, von denen einige eine doppelte Invasion Phänotyp ¹³ haben isoliert. Mögliche Auswirkungen auf die Invasion kann mit Hilfe der sogenannten Rot-Grün-Assay, die aus Nicht-Parasiten eingedrungen durch Differential-Antikörper-Färbung differenziert ^23,24 überfallen werden. Für beide Inva…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments
ENU	Sigma-Aldrich	N3385	1 M Stock in DMSO, store at -20°C
EMS	Sigma-Aldrich	M0880	1 M Stock in DMSO, store at -20°C
Dextran Sulfate	Sigma-Aldrich	D4911
PDTC	Sigma-Aldrich	P8765	100 mM Stock in PBS
Diff Quick	EMD Chemicals	65044-93
Filter holder	Cole-Parmer	540100
3 μm polycarbonate filter	Whatman Schleicher & Schuell	110612
Hemocytometer	Hausser Scientific	1475
CO2 incubators	Various manufacturers		Humidified, 5% CO2, at 35, 37 and 40°C
Fluorescence microscope	Various manufacturers		Ideally inverted, wide-field with 63x or 100x oil objective

HBSSc (according to Black et al.¹¹):

• 98.0 ml Hanks Balanced Salt Solution (Hyclone catalog number SH30588)
• 100 μl 1M MgCl₂ (100 mM end)
• 100 μl 1M CaCl₂ (100 mM end)
• 2.0 ml 1M Hepes pH 7.3 (20 mM end)
• 84 mg NaHCO₃ (10 mM end)