Efflusso test Colesterolo
Summary
Il saggio del colesterolo è progettato per quantificare il tasso di efflusso colesterolo da cellule coltivate e la capacità di plasma accettori di accettare il colesterolo rilasciato dalle cellule. Il saggio è costituito da cellule con l'etichettatura del colesterolo, del colesterolo equilibrio tra le piscine e il rilascio intracellulare del colesterolo ad un accettore extracellulare.
Abstract
Contenuto di colesterolo delle cellule deve essere mantenuta entro i limiti molto stretti, troppo o troppo poco colesterolo in un risultato cellulari in rottura delle membrane cellulari, l'apoptosi e necrosi 1. Le cellule possono colesterolo di origine da sintesi intracellulare e da lipoproteine plasmatiche, entrambe le fonti sono sufficienti per soddisfare a pieno le esigenze cellule 'per il colesterolo. I processi di sintesi del colesterolo e l'assorbimento sono strettamente regolati e carenze di colesterolo sono rare 2. Eccesso di colesterolo è di 3 problema più comune. Con l'eccezione di epatociti e ad alcune celle di laurea corticosurrenali, le cellule sono in grado di degradare il colesterolo. Le cellule hanno due opzioni per ridurre il loro contenuto di colesterolo: il colesterolo per convertire in esteri del colesterolo, un'opzione con una capacità limitata di sovraccaricare le celle con esteri del colesterolo è anche tossico, e di efflusso del colesterolo, un'opzione con una capacità potenzialmente illimitata. Efflusso di colesterolo è una specific processo che è regolato da una serie di trasportatori intracellulari, come ATP binding cassette transporter A1 proteine (ABCA1) e G1 (ABCG1) e del recettore scavenger di tipo B1. L'accettore naturale di colesterolo nel plasma è lipoproteine ad alta densità (HDL) e di apolipoproteina AI.
Il saggio di efflusso di colesterolo è stato progettato per quantificare la velocità di efflusso di colesterolo dalle cellule in coltura. Si misura la capacità delle cellule di mantenere efflusso colesterolo e / o la capacità di plasma accettori di accettare il colesterolo rilasciato dalle cellule. Il saggio è costituito dai seguenti passaggi. Fase 1: etichettatura colesterolo cellulare con l'aggiunta di colesterolo marcato al siero contenente medio e incubazione con cellule per 24-48 ore. Questo passaggio può essere combinato con caricamento di cellule con colesterolo. Fase 2: incubazione di cellule a terreno privo di siero di colesterolo marcato equilibrare tra tutti i lotti di colesterolo intracellulare. Questa fase può essere combinato con l'attivazione del cellulare cholesterol trasportatori. Fase 3: incubazione delle cellule con accettore extracellulare e quantificazione di movimento di colesterolo marcato da cellule al accettore. Se precursori del colesterolo sono stati utilizzati per etichettare colesterolo neosintetizzata, una quarta fase, purificazione di colesterolo, può essere richiesto.
Il dosaggio fornisce le seguenti informazioni: (i) come un particolare trattamento (una mutazione, un knock-down, una sovraespressione o un trattamento), riguarda la capacità della cellula di colesterolo efflusso e (ii) come la capacità di accettori plasma ad accettare colesterolo è affetto da una malattia o un trattamento. Questo metodo viene spesso utilizzato nel contesto della ricerca cardiovascolare, malattie metaboliche e neurodegenerative, malattie infettive e riproduttivi.
Protocol
Discussion
Il metodo descritto per misurare il colesterolo efflusso è progettato per misurare il movimento del colesterolo da cellule ad un accettore colesterolo extracellulare. Ci sono diverse considerazioni critiche nella comprensione di questa metodologia.
Etichettatura ed equilibratura
Nella metodologia descritta colesterolo marcato viene aggiunto siero contenente siero. Sebbene non esaminati in dettaglio, si presume che il colesterolo è incorporato in lipoproteine ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto dalle concessioni dal National Health and Medical Research Council of Australia (NHMRC) (526.615 e 545.906) e in parte dal Programma OIS del Governo del Victoria. DS è un collega di NHMRC.
Materials
| ReagentsCells | HeLa | THP-1 | RAW | HUVEC | BHK-21 | HFF |
| Complete Media | RPMI – 10% FCS – 1% L-glutamine – 0.2% Pen strep |
M199 – 5% FCS – 1% L-glutamine – 1% Pen strep – 2% HEPES (1M) – 7% Endothelial cell growth supplement (ECGS) |
DMEM – 10% FCS – 1% L-glutamine – 0.2% Pen strep |
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| Serum Free Media | RPMI – 1% L-glutamine – 0.2% Pen strep |
M199 – 1% L-glutamine – 1% Pen strep – 2% HEPES (1M) – 7% Endothelial cell growth supplement (ECGS) |
DMEM – 1% L-glutamine – 0.2% Pen strep |
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| Passage Method | 1 x Trypsin | Suspension | Scrape | 1 x Trypsin | ||
| Passage Ratio | 3:10 | 1:3 | 1:20 | 1:3 | 1:3 | |
| Cell Activation (optional) | TO-901317 – LXR-agonist – Final conc. 4 μM |
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| Other Reagents | phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) – Cell differentiation – Final conc. 0.1μg/ml |
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Referências
- Tabas, I. Cholesterol in health and disease. J. Clin. Invest. 110, 583-590 (2002).
- Brown, M. S., Goldstein, J. L. Cholesterol feedback: from Schoenheimer’s bottle to Scap’s MELADL. J. Lipid Res. 50, 15-27 (2009).
- Tabas, I. Consequences of cellular cholesterol accumulation: basic concepts and physiological implications. J. Clin. Invest. 110, 905-911 (2002).
- Murphy, A. J. High-Density Lipoprotein Reduces the Human Monocyte Inflammatory Response. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 28, 2071-2077 (2008).
- Mujawar, Z. Human Immunodeficiency Virus Impairs Reverse Cholesterol Transport from Macrophages. PLoS Biology. 4, 365-36 (2006).
- Patel, S. Reconstituted High-Density Lipoprotein Increases Plasma High-Density Lipoprotein Anti-Inflammatory Properties and Cholesterol Efflux Capacity in Patients With Type 2 Diabetes. J. Am. Coll. Cardiol. 53, 962-971 (2009).
- Shaw, J. A. Infusion of reconstituted high-density lipoprotein leads to acute changes in human atherosclerotic plaque. Circ. Res. 103, 1084-1091 (2008).
- Kekulawala, R. J. Impact of freezing on high-density lipoprotein functionality. Anal. Biochem. 379, 75-77 (2008).
- D’Souza, W. Structure/Function Relationships of Apolipoprotein A-I Mimetic Peptides: Implications for Antiatherogenic Activities of High-Density Lipoprotein. Circ. Res. 107, 217-227 (2010).
- Tchoua, U. The effect of cholesteryl ester transfer protein overexpression and inhibition on reverse cholesterol transport. Cardiovasc Res. 77, 732-739 (2008).
- Mukhamedova, N. Enhancing apolipoprotein A-I-dependent cholesterol efflux elevates cholesterol export from macrophages in vivo. J. Lipid Res. 49, 2312-2322 (2008).
- Mukhamedova, N., Fu, Y., Bukrinsky, M., Remaley, A. T., Sviridov, D. The Role of Different Regions of ATP-Binding Cassette Transporter A1 in Cholesterol Efflux. Bioquímica. 46, 9388-9398 (2007).
- Sviridov, D., Fidge, N., Beaumier-Gallon, G., Fielding, C. Apolipoprotein A-I stimulates the transport of intracellular cholesterol to cell-surface cholesterol-rich domains (caveolae. Biochem. J. 358, 79-86 (2001).
- Smyth, I. A mouse model of harlequin ichthyosis delineates a key role for abca12 in lipid homeostasis. PLoS Genet. 4, e1000192-e1000192 (2008).
- Fu, Y. Expression of Caveolin-1 Enhances Cholesterol Efflux in Hepatic Cells. J. Biol. Chem. 279, 14140-14146 (2004).
- Calkin, A. C. Reconstituted High-Density Lipoprotein Attenuates Platelet Function in Individuals With Type 2 Diabetes Mellitus by Promoting Cholesterol Efflux. Circulation. 120, 2095-2104 (2009).
