運動ニューロンにマウス胚性幹細胞の効率的な分化
Summary
我々は運動ニューロンにマウス胚性幹細胞のインビトロ分化の効率を改善するための新しいプロトコルを開発しました。として免疫組織化学的手法を用いてニューロンと運動ニューロンマーカーの発現によって証明機能を分化したES細胞は運動ニューロンを取得しました。
Abstract
機能的な運動ニューロンへの胚性幹（ES）細胞の直接分化は、病気のメカニズムを研究するための新しい薬剤化合物をスクリーニングするために、このような脊髄性筋萎縮症（SMA）および筋萎縮性側索硬化症などの運動ニューロン疾患の新しい治療法を開発するための有望なリソースを表します（ ALS）。現在の多くのプロトコルは、運動ニューロン1月4日に、マウス胚性幹（MES）の細胞を区別するために、レチノイン酸（RA）とソニックヘッジホッグ（Shh）の組み合わせを使用します。しかし、運動ニューロンへのMES細胞の分化効率は中程度の成功を収めている。我々は大幅に現在確立されているプロトコルと比べて分化効率を向上させる二段階の分化プロトコル5を開発しました。最初のステップは、ノギンと線維芽細胞増殖因子（FGFの）を追加することによって、神経誘導プロセスを強化することです。ノギンは骨形成タンパク質（BMP）のアンタゴニストであると神経誘導に関与している前方神経パターニング6の形成におけるニューロン新生と結果のデフォルトのモデルにccording。 FGFシグナリングは、後部神経アイデンティティ7-9を促進することにより、神経組織の形成を誘導するノギンと相乗的に作用する。このステップでは、MESの細胞は、神経系統に向かって分化を促進するために二日間ノギン、bFGFを、とFGF-8でプライミングされた。第二段階では、運動ニューロンの仕様を誘導することである。ノギン/ FGFの露出したMESの細胞が運動ニューロンの生成を容易にするために、別の5日間、RAとShhのアゴニスト、Smoothenedのアゴニスト（SAG）とインキュベートした。運動ニューロンへの混乱の分化をモニターするために、我々は運動ニューロン特異的プロモーターHb9 1の制御下でEGFPを発現するトランスジェニックマウス由来のES細胞株を使用していました。この堅牢なプロトコルを使用して、我々は±分化効率の0.8％の51を達成した（n = 3、P <0.01、スチューデントの t検定）5。免疫からの結果染色は、GFP +細胞は運動ニューロン特異的マーカー、膵島-1およびコリンアセチルトランスフェラーゼ（ChATの）を発現することを示した。私たちの二段階分化プロトコルは、脊髄運動ニューロンにMESの細胞を区別するための効率的な方法を提供します。
Protocol
Discussion
MES細胞の質が運動ニューロンの効率的な生成のための最も重要なパラメータです。 MESの細胞は、自発的な分化を防止するためにPMEFで栽培する必要があります。 LIFの添加により、未分化状態のMES細胞を維持するのに役立ちます。 MESの細胞はすべての12から15時間を分割するので、培地は急速に枯渇し、毎日交換する必要がありますとなります。
ソニックヘッジホッグ経?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この原稿は2011年5月26日に亡くなった博士Wenlan王の記憶に捧げられています。我々は寛大に本研究で用いたHBG3 MES細胞を提供するために博士はダグラスA.カーに感謝します。この作品は、ヌムールによって資金を供給され、研究資源のナショナルセンター（NCRR）、およびセンターをサポートするNCRRからCOBRE助成賞（5 P20 RR020173-05）のINBREプログラムの下で助成金（2 RR016472-10）子供たちは、ウィルミントン、デラウェア州、アメリカ合衆国のためにアルフレッドI.デュポン病院で小児研究。
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Final concentration |
| PMEF | Millipore | PMEF-H | N.A. |
| PMEF medium | |||
| DMEM | Invitrogen | 11965-118 | N.A. |
| FBS | Invitrogen | 16140-071 | 10% |
| L-glutamine | Invitrogen | 25030-081 | 1% |
| Penicillin/streptomycin | Invitrogen | 15240-063 | 1% |
| mES medium | |||
| DMEM | StemCell Technologies | 36250 | N.A. |
| ES Cell-Qualified FBS | Invitrogen | 16141-079 | 15% |
| GlutaMax-I | Invitrogen | 35050-061 | 1% |
| Non-essential amino acids | Invitrogen | 11140-050 | 1% |
| Nucleosides | Millipore | ES-008-D | 1% |
| β-mercaptoethanol | Millipore | ES-007-E | 0.1 mM |
| Penicillin/streptomycin | Millipore | TMS-AB2-C | 1% |
| LIF | Millipore | LIF2010 | 10 ng/ml |
| Neural Differentiation medium | |||
| DMEM | StemCell Technologies | 36250 | N.A. |
| ES Cult FBS | StemCell Technologies | 06905 | 15% |
| Non-essential amino acids | Invitrogen | 11140-050 | 1% |
| Mono-thio glycerol | Sigma-Aldrich | M-6145 | 1mM |
| Noggin | Invitrogen | PHC1506 | 50 ng/ml |
| FGF-8 | Invitrogen | PHG0274 | 20 ng/ml |
| bFGF | Invitrogen | PHG0024 | 20 ng/ml |
| MND medium (differentiation) | |||
| ES-Cult Basal Medium-A | StemCell Technologies | 5801 | N.A. |
| Knockout serum replacement | Invitrogen | 10828-028 | 10% |
| N-2 supplement | Invitrogen | 17502-048 | 1% |
| ITS Supplement-B | StemCell Technologies | 07155 | 1% |
| Ascorbic acid | StemCell Technologies | 07157 | 1% |
| Penicillin/streptomycin | Millipore | TMS-AB2-C | 1% |
| GlutaMax-I | Invitrogen | 35050-061 | 1% |
| D-glucose | Sigma-Aldrich | G-8270 | 0.15% in d2H2O |
| Fibronectin | StemCell Technologies | 07159 | 5 μg/ml |
| Heparin | Sigma-Aldrich | H3149 | 20 μg/ml in d2H2O |
| β-mercaptoethanol | Millipore | ES-007-E | 0.1 mM |
| Retinoic Acid | Sigma-Aldrich | R-2625 | 1 μM |
| SAG | EMD Chemicals | 566660 | 1 μM |
| MND medium (Motor Neuron culture) | |||
| ES-Cult Basal Medium-A | StemCell Technologies | 5801 | N.A. |
| Knockout serum replacement | Invitrogen | 10828-028 | 10% |
| N-2 supplement | Invitrogen | 17502-048 | 1% |
| ITS Supplement-B | StemCell Technologies | 07155 | 1% |
| Ascorbic acid | StemCell Technologies | 07157 | 1% |
| Penicillin/streptomycin | Millipore | TMS-AB2-C | 1% |
| GlutaMax-I | Invitrogen | 35050-061 | 1% |
| D-glucose | Sigma-Aldrich | G-8270 | 0.15% in d2H2O |
| Fibronectin | StemCell Technologies | 07159 | 5 μg/ml |
| Heparin | Sigma-Aldrich | H3149 | 20 μg/ml in d2H2O |
| β-mercaptoethanol | Millipore | ES-007-E | 0.1 mM |
| BDNF | R&D Systems | 248-BD-005/CF | 10 ng/ml |
| CNTF | R&D Systems | 257-NY-010/CF | 10 ng/ml |
| GDNF | R&D Systems | 212-GD-010/CF | 10 ng/ml |
| NT-3 | R&D Systems | 267-N3-005/CF | 10 ng/ml |
N.A. = Non-applicable.
Table 1. PMEF and Media for mES cell culture or differentiation.
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Final Concentration |
| 0.1% Gelatin | StemCell Technologies | 07903 | N.A. |
| Poly-DL-ornithine | Sigma-Aldrich | P0421 | 0.1 mg/ml in d2H2O |
| Mouse laminin | Millipore | CC095 | 2 μg/ml in PBS |
| 0.25% Trypsin/EDTA | StemCell Technologies | 07901 | N.A. |
| Accumax | Millipore | SCR006 | N.A. |
N.A. = Non-applicable.
Table 2. Reagents for coating and dissociation.
Referências
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