Isolamento primario Microglia misti da colture cellulari gliali del tessuto neonatale cervello di ratto
Summary
Isolamento microglia primaria dalla eterogeneità cellulare del cervello è essenziale per studiare il loro ruolo sia in condizioni fisiologiche e patologiche. Questo protocollo descrive un isolamento meccanico e mista tecnica di coltura cellulare che fornisce alta resa ed elevata purezza, cellule vitali primarie per microgliali<em> In vitro</em> Studio e applicazioni a valle.
Abstract
Conto Microglia per circa il 12% della popolazione cellulare totale nel cervello dei mammiferi. Mentre i neuroni e astrociti sono considerati i principali tipi di cellule del sistema nervoso, microglia svolgere un ruolo importante nella fisiologia normale del cervello attraverso il monitoraggio del tessuto per detriti e agenti patogeni e di mantenere l'omeostasi nel parenchima via 1,2 attività fagocitaria. Microglia vengono attivati nel corso di una serie di condizioni di pregiudizio e malattia, tra cui le malattie neurodegenerative, lesioni cerebrali traumatiche, e l'infezione del sistema nervoso 3. In queste condizioni attivanti, microglia aumentare la loro attività fagocitaria, subire una modifica morpohological e proliferativi, e attivamente secernono le specie reattive dell'ossigeno e dell'azoto, pro-infiammatorie chemochine e citochine, spesso l'attivazione di un loop paracrino o autocrino 4-6. Come queste risposte microgliali contribuire alla patogenesi della malattia in condizioni neurologiche, ricerca incentrata sulla microglia è garantito.
A causa della eterogeneità cellulare del cervello, è tecnicamente difficile ottenere sufficiente materiale microglia campione con elevata purezza Durante gli esperimenti in vivo. La ricerca attuale sulle funzioni neuroprotettive e neurotossici di microglia richiedono un metodo di routine tecnica per generare costantemente microglia puro e sano con rendimento sufficiente per lo studio. Presentiamo, nel testo e video, un protocollo per isolare puro microglia primaria da colture miste glia per una varietà di applicazioni a valle. In breve, questa tecnica utilizza il tessuto cerebrale dissociata da ratti neonati per la produzione di colture miste di cellule gliali. Dopo le colture miste gliali raggiungano la confluenza, microglia primari sono meccanicamente isolato dalla coltura mediante una durata breve agitazione. Le microglia vengono quindi piastrate ad elevata purezza per studio sperimentale.
Il principio e il protocollo di questa metodologia sono statidescritto in letteratura 7,8. Inoltre, le metodologie alternative per isolare microglia primaria sono ben descritte 9-12. Tessuto cerebrale omogeneizzati possono essere separate mediante centrifugazione in gradiente di densità a cedere primaria microglia 12. Tuttavia, la centrifugazione è di lunghezza moderata (45 min) e può causare danni cellulari e attivazione, così come, causano arricchito microglia e altre popolazioni cellulari. Un altro protocollo è stato utilizzato per isolare microglia primaria in una varietà di organismi da prolungato (16 ore) agitando mentre nella cultura 9-11. Dopo aver agitato, il surnatante dei media viene centrifugato per isolare microglia. Questo metodo di isolamento più due fasi possono anche turbare la funzione e l'attivazione della microglia. Si utilizzano principalmente il seguente protocollo di isolamento microglia nel nostro laboratorio per una serie di ragioni: (1) primaria microglia simulare de biologia vivo più fedelmente rispetto alle linee di cellule microglia immortalati roditori, (2) Rottura nominale meccanica minimizza potenziale disfunzione cellulare o l'attivazione, e (3) resa sufficiente può essere ottenuta senza passaggio delle colture miste di cellule gliali.
È importante notare che questo protocollo utilizza tessuto cerebrale da ratti neonati per isolare microglia e che utilizzando ratti anziani isolare microglia possono influenzare notevolmente la resa, stato di attivazione, e le proprietà funzionali della microglia isolato. Ci sono prove che l'invecchiamento è collegato con disfunzione microglia, neuroinfiammazione aumentata e patologie neurodegenerative, studi precedenti hanno quindi utilizzati ex vivo adulti microglia per comprendere meglio il ruolo della microglia nelle malattie neurodegenerative in cui l'invecchiamento è importante parametro. Tuttavia, ex vivo microglia non possono essere mantenute in coltura per periodi di tempo prolungati. Pertanto, mentre questo protocollo prolunga la vita della microglia in coltura primaria, va osservato che la microglia comportarsi differently da adulto microglia e studi in vitro deve essere attentamente considerato quando tradotto de un ambiente vivo.
Protocol
Discussion
Mentre questo protocollo viene normalmente utilizzato per produrre microglia puro e sano per esperimenti di ricerca, un attento esame degli aspetti tecnici durante parti critiche della procedura minimizzare la variabilità nel microglia isolato. In primo luogo, durante la dissezione di tessuto cerebrale di ratti neonati, lavorando in modo tempestivo è necessario minimizzare il danno ipossico ischemico e al tessuto. Tuttavia, è anche importante per rimuovere completamente il rivestimento meningeo dal cervello durante l…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Finanziato dal programma intramurale presso l'Università Uniformed Services.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalog number | Comments |
| 60 mm x 15 mm Petri dishes | Fisher brand | 0875713A | |
| Sharp dissecting scissors | Fine Science Tools | 14094-11 | |
| Dumont #7b forceps- standard tips, curved, 11cm | Fine Science Tools | 11270-20 | |
| Dumont #5 forceps-standard tips, straight, 11 cm | Fine Science Tools | 11251-10 | |
| 50 ml conical centrifuge tubes | VWR | 89039-656 | |
| 5 ml serological pipettes | Grenier Bio One | 606180 | |
| 10 ml serological pipettes | Grenier Bio One | 607180 | |
| 100 μm sterile nylon cell strainer | Falcon | 35-2360 | |
| 75 cm2 tissue culture flasks | Corning | 430641 | |
| Dulbecco’s minimal essential medium (DMEM) | Gibco (Invitrogen) | 31053-028 | |
| Leibovitz’s L-15 medium | Gibco (Invitrogen) | 11415064 | |
| Fetal bovine serum | Gibco(Invitrogen) | 16000-036 | |
| Fetal equine serum | Fisher | SH3007402 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco (Invitrogen) | 15140163 | |
| 100% Ethanol | The Warner Graham Company | 64-17-5 | |
| Phosphate buffered saline solution, 10X, pH 7.4 | Quality Biological, inc. | 119-069-131 | 1X in sterile, distilled water |
| Biohazard bags | VWR | 14220-028 | |
| Haemocytometer | Hausser Scientific | 1492 | |
| 6-well cell culture plates with cellBIND surface | Corning | 3335 |
Referências
- Ransohoff, R. M., Perry, V. H. Microglial physiology: unique stimuli, specialized responses. Annu. Rev. Immunol. 27, 119-145 (2009).
- Raivich, G., Bohatschek, M., Kloss, C. U., Werner, A., Jones, L. L., Kreutzberg, G. W. Neuroglial activation repertoire in the injured brain: graded response, molecular mechanisms and cues to physiological function. Brain Res. Brain Res. Rev. 30, 77-105 (1999).
- Loane, D. J., Byrnes, K. R. Role of microglia in neurotrauma. Neurotherapeutics. 7, 245-265 (2010).
- Glass, C. K., Saijo, K., Winner, B., Marchetto, M. C., Gage, F. H. Mechanisms underlying inflammation in neurodegeneration. Cell. 140, 918-934 (2010).
- Pocock, J. M., Liddle, A. C. Microglial signalling cascades in neurodegenerative disease. Prog. Brain Res. 132, 555-565 (2001).
- Block, M. L., Hong, J. S. Chronic microglial activation and progressive dopaminergic neurotoxicity. Biochem. Soc. Trans. 35, 1127-1132 (2007).
- Barger, S. W., Basile, A. S. Activation of microglia by secreted amyloid percursor protein evokes release of glutamate by cystine exchange and attenuates synpatic function. J. Neurochem. 76, 846-854 (2001).
- Ni, M., Aschner, M. Neonatal rat primary microglia: isolation, culturing, and selected applications. Curr. Protoc. Toxicol. Chapter 12, Unit 12.17 (2010).
- Hassan, N. F., Rifat, S., Campbell, D. E., McCawley, L. J., Douglas, S. D. Isolation and flow cytometric characterization of newborn mouse brain-derived microglia maintained in vitro. J. Leukoc. Biol. 50, 86-92 (1991).
- Hassan, N. F., Prakash, K., Chehimi, J., McCawley, L. J., Douglas, S. D. Isolation and characterization of newborn rabbit brain-derived microglia. Clin. Immunol. Immunopathol. 59, 426-435 (1991).
- Hassan, N. F., Campbell, D. E., Rifat, S., Douglas, S. D. Isolation and characterization of human fetal brain-derived microglia in in vitro culture. Neurociência. 41, 149-158 (1991).
- Frank, M. G., Wieseler-Frank, J. L., Watkins, L. R., Maier, S. F. Rapid isolation of highly enriched and quiescent microglia from adult rat hippocampus: immunophenotypic and functional characteristics. J. Neurosci. Methods. 151, 121-130 (2006).
- Byrnes, K. R., Stoica, B., Loane, D. J., Riccio, A., Davis, M. I., Faden, A. I. Metabotropic glutamate receptor 5 activation inhibits microglial associated inflammation and neurotoxicity. Glia. 57, 550-560 (2009).
- Loane, D. J., Stoica, B. A., Pajoohesh-Ganji, A., Byrnes, K. R., Faden, A. I. Activation of metabotropic glutamate receptor 5 modulates microglial reactivity and neurotoxicity by inhibiting NADPH oxidase. J. Biol. Chem. 284, 15629-15639 (2009).
