初级小胶质细胞的分离，从新生大鼠脑组织胶质细胞混合文化
Summary
隔离初级小胶质细胞的大脑细胞的异质性是必不可少的，以调查他们在生理和病理条件下的作用。本协议描述了机械隔离和混合细胞培养技术，提供高产量和高纯度的，可行的初级小胶质细胞<em>在体外</em>学习和下游应用。
Abstract
小胶质细胞在哺乳动物的脑细胞的总人口约12％的帐户。虽然神经元和神经胶质细胞被认为是神经系统的主要类型的细胞，小胶质细胞发挥 显著作用，在正常脑组织的生理组织碎片和病原体监测和维持动态平衡通过吞噬活性1,2实质。小胶质细胞被激活过程中的损伤和疾病的条件，包括神经退行性疾病，脑外伤，中枢神经系统感染3。这些活化条件下，增加小胶质细胞的吞噬活性，经过morpohological和增殖的变化，积极分泌活性氧和氮物种，促炎性趋化因子和细胞因子，往往激活旁分泌或自分泌环4-6。由于这些小胶质细胞反应在神经系统疾病的发病机制的研究主要集中在microglia保证。
由于大脑细胞的异质性，这是技术上的困难，具有纯度高，在体内实验中获得足够的小胶质细胞的样品材料。小胶质细胞的神经保护和神经功能的研究现状，需要常规的技术方法始终产生足够的产量为研究的纯洁和健康的小胶质细胞。我们提出，在文字和视频，从混合胶质文化的隔离纯初级小胶质细胞的各种下游应用协议。简单地说，这种技术采用分离新生幼鼠脑组织生产混合胶质细胞培养。混合胶质细胞培养达到汇合后，小胶质细胞主要是机械分离的文化由摇晃的时间很短。小胶质细胞，然后镀上高纯度的实验研究。
这种方法的原理和协议在文献7,8所述。此外，隔离初级小胶质细胞的替代方法有很好的描述9-12。匀浆脑组织可通过密度梯度离心分离，产生初级小胶质细胞12。然而，离心是适中的长度（45分钟），并可能会导致细胞损伤和激活，以及，导致富含胶质细胞和其他细胞群。另一个协议已动用隔离初级小胶质细胞的各种生物通过长时间的晃动，而在文化9-11（16小时）。摇动后，媒体上清离心分离小胶质细胞。这不再两步分离方法也可能干扰小胶质细胞的功能和激活。我们主要是利用以下的小胶质细胞的分离协议在我们的实验室有许多原因：（1）初级小胶质细胞在体内的生物学模拟更忠实，比永生的灭鼠小胶质细胞株（2）额定机械破坏，最大限度地减少潜在的细胞功能障碍或激活，（3）没有足够的产量可以通过混合胶质细胞培养获得。
重要的是要注意该协议使用新生幼鼠脑组织小胶质细胞分离和使用旧的大鼠，分离小胶质细胞可以显着影响产量，激活状态，孤立的小胶质细胞的功能特性。有证据表明，老龄化与小胶质细胞功能障碍，增加神经发炎和神经退行性病变的联系，所以以前的研究都采用体外成人小胶质细胞小胶质细胞在神经退行性疾病中的作用更好地了解地方老龄化是一个重要参数。但是，小胶质细胞体外不能被保存在长时间的文化。因此，虽然该协议扩展了初级小胶质细胞中的文化生活，也应注意到，小胶质细胞的行为ðifferently从成人的胶质细胞和体外研究时，应慎重考虑翻译体内设置。
Protocol
Discussion
虽然此协议经常用来生产纯净和健康的小胶质细胞的研究实验，在程序的关键部件的技术方面的慎重考虑，将尽量减少在孤立的小胶质细胞的变化。首先，是要尽量减少缺氧和缺血性脑损伤的组织，在新生幼鼠脑组织工作，及时清扫。然而，同样重要的是从大脑中彻底清除脑膜覆盖在解剖，因为在场的脑膜将有助于显着的成纤维细胞污染，由于这些培养条件下的快速增殖率。
<p class="jove_content"…Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
在统一服务大学的校内计划资助。
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalog number | Comments |
| 60 mm x 15 mm Petri dishes | Fisher brand | 0875713A | |
| Sharp dissecting scissors | Fine Science Tools | 14094-11 | |
| Dumont #7b forceps- standard tips, curved, 11cm | Fine Science Tools | 11270-20 | |
| Dumont #5 forceps-standard tips, straight, 11 cm | Fine Science Tools | 11251-10 | |
| 50 ml conical centrifuge tubes | VWR | 89039-656 | |
| 5 ml serological pipettes | Grenier Bio One | 606180 | |
| 10 ml serological pipettes | Grenier Bio One | 607180 | |
| 100 μm sterile nylon cell strainer | Falcon | 35-2360 | |
| 75 cm2 tissue culture flasks | Corning | 430641 | |
| Dulbecco’s minimal essential medium (DMEM) | Gibco (Invitrogen) | 31053-028 | |
| Leibovitz’s L-15 medium | Gibco (Invitrogen) | 11415064 | |
| Fetal bovine serum | Gibco(Invitrogen) | 16000-036 | |
| Fetal equine serum | Fisher | SH3007402 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco (Invitrogen) | 15140163 | |
| 100% Ethanol | The Warner Graham Company | 64-17-5 | |
| Phosphate buffered saline solution, 10X, pH 7.4 | Quality Biological, inc. | 119-069-131 | 1X in sterile, distilled water |
| Biohazard bags | VWR | 14220-028 | |
| Haemocytometer | Hausser Scientific | 1492 | |
| 6-well cell culture plates with cellBIND surface | Corning | 3335 |
Referências
- Ransohoff, R. M., Perry, V. H. Microglial physiology: unique stimuli, specialized responses. Annu. Rev. Immunol. 27, 119-145 (2009).
- Raivich, G., Bohatschek, M., Kloss, C. U., Werner, A., Jones, L. L., Kreutzberg, G. W. Neuroglial activation repertoire in the injured brain: graded response, molecular mechanisms and cues to physiological function. Brain Res. Brain Res. Rev. 30, 77-105 (1999).
- Loane, D. J., Byrnes, K. R. Role of microglia in neurotrauma. Neurotherapeutics. 7, 245-265 (2010).
- Glass, C. K., Saijo, K., Winner, B., Marchetto, M. C., Gage, F. H. Mechanisms underlying inflammation in neurodegeneration. Cell. 140, 918-934 (2010).
- Pocock, J. M., Liddle, A. C. Microglial signalling cascades in neurodegenerative disease. Prog. Brain Res. 132, 555-565 (2001).
- Block, M. L., Hong, J. S. Chronic microglial activation and progressive dopaminergic neurotoxicity. Biochem. Soc. Trans. 35, 1127-1132 (2007).
- Barger, S. W., Basile, A. S. Activation of microglia by secreted amyloid percursor protein evokes release of glutamate by cystine exchange and attenuates synpatic function. J. Neurochem. 76, 846-854 (2001).
- Ni, M., Aschner, M. Neonatal rat primary microglia: isolation, culturing, and selected applications. Curr. Protoc. Toxicol. Chapter 12, Unit 12.17 (2010).
- Hassan, N. F., Rifat, S., Campbell, D. E., McCawley, L. J., Douglas, S. D. Isolation and flow cytometric characterization of newborn mouse brain-derived microglia maintained in vitro. J. Leukoc. Biol. 50, 86-92 (1991).
- Hassan, N. F., Prakash, K., Chehimi, J., McCawley, L. J., Douglas, S. D. Isolation and characterization of newborn rabbit brain-derived microglia. Clin. Immunol. Immunopathol. 59, 426-435 (1991).
- Hassan, N. F., Campbell, D. E., Rifat, S., Douglas, S. D. Isolation and characterization of human fetal brain-derived microglia in in vitro culture. Neurociência. 41, 149-158 (1991).
- Frank, M. G., Wieseler-Frank, J. L., Watkins, L. R., Maier, S. F. Rapid isolation of highly enriched and quiescent microglia from adult rat hippocampus: immunophenotypic and functional characteristics. J. Neurosci. Methods. 151, 121-130 (2006).
- Byrnes, K. R., Stoica, B., Loane, D. J., Riccio, A., Davis, M. I., Faden, A. I. Metabotropic glutamate receptor 5 activation inhibits microglial associated inflammation and neurotoxicity. Glia. 57, 550-560 (2009).
- Loane, D. J., Stoica, B. A., Pajoohesh-Ganji, A., Byrnes, K. R., Faden, A. I. Activation of metabotropic glutamate receptor 5 modulates microglial reactivity and neurotoxicity by inhibiting NADPH oxidase. J. Biol. Chem. 284, 15629-15639 (2009).
