O protocolo descreve um sistema de modelo eficiente e reprodutível para estudar vírus herpes simplex tipo 1 (HSV-1) a latência e reactivação. O ensaio emprega homogéneos culturas de neurónios simpáticos e permite a dissecção molecular do vírus de neurónios-interacções usando uma variedade de ferramentas, incluindo a interferência de RNA e de expressão de proteínas recombinantes.
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Artigo de método
Um sistema de cultura primária Neuron para o Estudo da Herpes Simplex Virus latência e reativação
Neste artigo
Resumo
Resumo
Herpes simplex virus tipo-1 (HSV-1) estabelece uma infecção latente ao longo da vida em neurónios periféricos. Este reservatório latente é a fonte de eventos de reactivação recorrentes que assegurar a transmissão e contribuir para doença clínica. Antivirais atuais não impactar o reservatório latente e não existem vacinas. Embora os detalhes moleculares de replicação lítica são bem caracterizados, mecanismos de controle de latência nos neurônios permanecem ainda desconhecidos. A nossa compreensão actual de latência é derivado a partir de estudos in vivo utilizando modelos animais pequenos, que têm sido indispensáveis para definir os requisitos de genes virais e do papel de respostas imunes. No entanto, é impossível distinguir efeitos específicos sobre a relação vírus neurónio-a partir de consequências mais gerais de infecção mediada por células de suporte imunes ou não-neuronais em animais vivos. Além disso, a experimentação animal é dispendiosa, morosa, e limitado em termos de opções disponíveis para a manipulação de acolhimentoprocessos. Para superar essas limitações, um sistema de neurônios-só é desesperadamente necessário que reproduz a características in vivo de latência e reativação, mas oferece os benefícios da cultura de tecidos em termos de homogeneidade e de acessibilidade.
Apresentamos aqui mais um modelo in vitro utilizando culturas de neurónios simpáticos primárias a partir de gânglios rato cervical superior (SCG) (Figura 1) para estudar o HSV-1 latência e reactivação que se encaixa se não de todos os critérios desejados. Depois de eliminar células não-neuronais, perto homogéneos TrkA culturas + de neurónios são infectadas com HSV-1 na presença de aciclovir (ACV) para suprimir a replicação lítica. Remoção ACV seguinte, não produtivos HSV-1 infecções que exibem características fielmente aceites de latência são eficientemente estabelecida. Notavelmente, os mRNAs líticas, proteínas, e vírus infeccioso tornar-se indetectável, mesmo na ausência de selecção, mas a latência associada transcrição (LAT) expressaion persiste em núcleos neuronal. Genomas virais são mantidas a um número de cópias médio de 25 por neurónio e podem ser induzidas a produtivamente replicar por interferir com PI3-quinase / sinalização Akt ou a retirada simples do factor de crescimento do nervo 1. Um recombinante HSV-1 EGFP codificação fundido com a proteína viral lítica US11 fornece um funcional, marcador de tempo real para a replicação resultante da reactivação que é facilmente quantificado. Além disso a tratamentos químicos, as metodologias genéticas tais como a entrega de RNA-interferência ou gene através lentivirais pode ser aplicado com sucesso para o sistema que permite estudos mecanísticos que são muito difíceis, se não impossível, em animais. Em resumo, a SCG baseado HSV-1 sistema de latência / reativação fornece uma poderosa ferramenta necessária para desvendar os mecanismos moleculares que controlam HSV1 latência e reativação de neurônios, um enigma de longa data em virologia cuja solução pode oferecer novas perspectivas no desenvolvimento de novas terapias que alvo tele latente reservatório herpesvírus.
Protocolo
1. Isolamento e cultura de neurônios Scg de embriões de ratos
Para proporcionar um contexto útil para a compreensão deste protocolo, e para uma discussão exaustiva da literatura anteriormente que métodos estabelecidos de SCG cultura neurónio, incluindo a base para SCG cultura in vitro, a placa de revestimento de substrato, e os componentes de meios isentos de soro, o leitor é remetido para referências de 2-4.
- O uso de ratos como uma fonte para os neurônios Scg foi conduzido de acordo com as diretrizes do NIH no âmbito de um protocolo ativo aprovada pelo Institutional Animal Care & Use Committee (IAC....
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Discussão
Esta cultura neurônio primário e sistema de infecção fornece um método simples e eficaz para explorar os mecanismos moleculares subjacentes HSV-1 latência e reativação. O sistema fielmente recapitula as características aceitas de latência definidos em ambas as infecções humanas e em modelos de animais vivos. Quando o vírus é latente nas culturas SCG, partículas virais infecciosas e produtos de genes líticas não pode ser detectado. O produto do gene virai detectado apenas em neurónios latentemente infect.......
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Divulgações
Não há conflitos de interesse declarados.
Agradecimentos
Agradecemos aos revisores por suas sugestões inteligentes que ajudaram a melhorar este manuscrito. Este trabalho foi suportado por concessões para MVC (NS21072, HD23315), ACW (GM61139, S10RR017970) e IM (AI073898, GM056927) do NIH. MK foi apoiado em parte por um treinamento NIH subvenção (5T32 AI007180).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Reagente | Companhia | Catalogo | Comentários |
| 70μm nylon filtro (coador de celular) | BD Biosciences | 352350 | |
| Solução 1x Salina Equilibrada de Hank (HBSS - / -) | Invitrogen | 14175 | w / o CaCl 2 e MgCl 2 |
| 1x mínimos Mídia Essenciais (MEM) | Invitrogen | 11095-080 | |
| 5-Fluoro-2'-desoxiuridina | Sigma | F0503 | preparar 20 mM em 1x MEM; armazenar a -20 ° C |
| 96-bem planas bem fundo placas TC | Corning | 3599 | |
| Aciclovir | Calbiochem | 114798 | preparar 31 mM em DMSO; armazenar a -20 ° C |
| Afidicolina | Calbiochem | 178273 | preparar 10 mM em DMSO; armazenar a -20 ° C |
| B-27 Suplemento | Invitrogen | 17504-44 | |
| Colagenase | Sigma | C2674 | preparar 10 mg / ml em HBSS estoque - / -; armazenar a -20 ° C |
| D-(+)-Glucose | Sigma | G6152 | preparar estoque 40% em H 2 O; filtro de esterilizar e armazenar a 4 ° C |
| L-Glutamina | Invitrogen | 25030-081 | |
| A laminina | Sigma | L2020 | preparar 1 mg / ml em estoque H 2O; rápido a congelar 20 laliquats e armazenar a -80 ° C; diluído para 2 mg / ml conc de trabalho. em estéril de H2O |
| Leibovit'z meio L-15 | Invitrogen | 11415 | |
| Fator de Crescimento do Nervo | Harlan Laboratories | BT.5017 | preparar 50 ug / ml em HBSS estoque - / -; armazenam a -80 ° C |
| Médio Neurobasal | Invitrogen | 12348 | |
| Fosfonoacético ácido (PAA) | Sigma | P6909 | preparar 75 mg / ml estoque em H2O; armazenar a -20 ° C |
| Poli-D-lisina bromidrato | Sigma | P0899 | preparar 20 mg / ml estoque em H2O; armazenar a -20 ° C |
| Rat-tail de colágeno | Millipore | 08-115 | Concentração varia com o lote de abastecimento; Armazenar a 4 ° C e diluída para 0,66 mg / ml conc de trabalho. em estéril de H2O |
| Tricostatina A | Sigma | T8552 | preparar 1 mM em DMSO; armazenar a -20 ° C |
| Tripsina 2,5% | Invitrogen | 15090-04 |
Referências
- Camarena, V., Kobayashi, M., Kim, J. Y., Roehm, P., Perez, R., Gardner, J., Wilson, A. C., Mohr, I., Chao, M. V. Nature and duration of growth factor signaling through receptor tyrosine kinases regulates HSV-1 latency in neurons. Cell Host & Microbe. 8, 320-330 (2010).
- Johnson, M. I. Primary cultures of sympathetic ganglia.
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Reimpressões e permissões
