De uma única célula perfil de imaturos e maduros neurônios da retina

Resumo

Um método para o isolamento de um único células da retina e amplificação subsequente dos seus ADNc é descrito. Unicelulares Transcritômica revela o grau de heterogeneidade celular presente num tecido e descobre genes novo marcador de populações de células raras. O protocolo que acompanha pode ser ajustado para se adequar muitos tipos de células diferentes.

Resumo

Populações altamente especializados, mas muito pequena de células desempenham um papel importante em muitos tecidos. A identificação de célula do tipo marcadores específicos e programas de expressão do gene para subconjuntos de células extremamente raras tem sido um desafio usando padrão de tecido todo de abordagens. Perfilamento gene expressão de células individuais permite um acesso sem precedentes para tipos de células que compreendem apenas uma pequena percentagem do tecido total de ^1-7. Além disso, esta técnica pode ser usado para examinar os programas de expressão génica que são transitoriamente expressa em pequenos números de células durante dinâmicas transições de desenvolvimento ^8.

Este problema surge da diversidade celular repetidamente no sistema nervoso central (CNS) onde as ligações neuronais pode ocorrer entre as células bastante diversas ^9. O número exacto de tipos de células distintas não é conhecida com precisão, mas estima-se que pode haver até 1000 tipos diferentes no i córtextself ^10. A função (s) de complexos circuitos neurais podem contar com alguns dos tipos raros neuronais e os genes se expressam. Através da identificação de novos marcadores e ajudando a molecularmente classificar neurónios diferentes, a abordagem de uma única célula é particularmente útil na análise de tipos de células no sistema nervoso. Pode também ajudar a elucidar os mecanismos de desenvolvimento neural, identificando genes diferencialmente expressos e vias de genes durante os estágios iniciais de desenvolvimento neuronal progenitor.

Como um tecido, de fácil acesso simples com a diversidade considerável neuronal, a retina vertebrado é um sistema modelo excelente para estudar os processos de desenvolvimento celular, diferenciação neuronal e diversificação neuronal. No entanto, como em outras partes do SNC, esta diversidade celular pode apresentar um problema para determinar os caminhos genéticos que levam progenitores da retina de adotar um destino célula específica, especialmente dado que os bastonetes compõem a maria da população total de células da retina ^11. Relatamos aqui um método para a identificação dos transcritos únicos expressos em células da retina (Figura 1). A técnica de perfis de célula única permite a avaliação da quantidade de heterogeneidade presente em diferentes populações celulares da retina ^2,4,5,12. Além disso, este método tem revelado uma série de novos genes candidatos que podem desempenhar um papel (s) no destino da célula de tomada de decisão processos que ocorrem em subconjuntos de células progenitoras da retina ^8. Com alguns ajustes simples para o protocolo, esta técnica pode ser utilizada para muitos tecidos diferentes e tipos de células.

Protocolo

1. A dissociação de células

1. Um fluxograma descrevendo o protocolo é mostrado é a Figura 1. Para obter os números de catálogo dos reagentes específicos utilizados ao longo deste protocolo, consulte a Tabela 1. Dissecar a retina num banho de PBS. Durante a dissecção, é melhor para remover o vítreo e da lente desde mantendo-os com a retina pode impedir a dissociação. Nem sempre é criticamente importante para remover todo o epitélio pigmentado da retina (RPE) e, em alguns casos, pode ser impossível de removê-la completamente. No entanto, para as experiências de células únicas de perfis de fotorreceptores, o RPE deve ser removi....

Discussão

Um número cada vez maior de estudos estão revelando variabilidade célula-célula robusta em populações que se acreditava serem mais homogêneas no que diz respeito à sua expressão gênica ^6,8. Em pelo menos um exemplo, este gene expressão "ruído" tem sido demonstrado que desempenham uma função importante biológica ^13. Diferenças de expressão gênica entre as células individuais são obscurecidos usando os tradicionais métodos de todo tecido. Essas experiências geram o perfil de expressão de um.......