Single-cell Profilering van het ontwikkelen en Jong netvlies Neuronen

Summary

Werkwijze voor het isoleren van een retinacellen en vervolgens amplificatie van de cDNA beschreven. Single-cell transcriptomics onthult de mate van cellulaire heterogeniteit aanwezig is in een tissue en onthult nieuwe marker-genen voor zeldzame celpopulaties. De bijbehorende protocol kan worden aangepast aan verschillende celtypen te passen.

Abstract

Zeer gespecialiseerde, maar zeer kleine populaties van cellen spelen een belangrijke rol in vele weefsels. De identificatie van cel-type specifieke markers en gen-expressie-programma's voor uiterst zeldzame cel subsets is een uitdaging met behulp van standaard hele weefsel benaderingen. Gene expression profiling van individuele cellen zorgt voor een ongekende toegang tot de celtypen die slechts een klein percentage van de totale weefsel ^1-7 omvatten. Bovendien kan deze methode worden de genexpressie's die tijdelijk worden uitgedrukt in een klein aantal cellen gedurende dynamische ontwikkeling overgangen ⁸ onderzoeken.

Dit nummer van cellulaire diversiteit ontstaat herhaaldelijk in het centrale zenuwstelsel (CZS), waar de neuronale verbindingen kunnen ontstaan ​​tussen zeer divers cellen ^9. Het exacte aantal verschillende celtypen is niet precies bekend, maar het is geschat dat er sprake kan zijn maar liefst 1000 verschillende soorten in de cortex itself ^10. De functie (s) van complexe neurale circuits kan beroepen op een aantal van de zeldzame neuronale types en de genen die ze uit te drukken. Door het identificeren van nieuwe markers en te helpen bij moleculair classificeren verschillende neuronen, de single-cell benadering is met name nuttig bij de analyse van celtypes in het zenuwstelsel. Het kan ook helpen om de mechanismen van neurale ontwikkeling toe te lichten door het identificeren van differentieel tot expressie genen en wegen tijdens de vroege stadia van de neuronale voorlopercellen ontwikkeling.

Als een eenvoudige, gemakkelijk te bereiken weefsel met veel neuronale diversiteit, de gewervelde netvlies is een uitstekend modelsysteem voor het bestuderen van de processen van ontwikkeling van de cellen, neuronale differentiatie en neuronale diversificatie. Echter, zoals in andere delen van het centrale zenuwstelsel, dit cellulair diversiteit kan een probleem vormen voor het bepalen van de genetische pathways die retinale voorouders rijden naar een specifieke lot van de cel vast te stellen, zeker gezien het feit dat staaf fotoreceptoren deel uitmaken van de mazal zijn van afwijkende de totale netvlies celpopulatie ^11. Hier rapporteren een methode voor de identificatie van de transcripten uitgedrukt in een retinacellen (figuur 1). De single-cell profiling techniek maakt het mogelijk voor de beoordeling van het bedrag van heterogeniteit aanwezig in verschillende cellulaire populaties van het netvlies ^2,4,5,12. Daarnaast is deze methode blijkt een groot aantal nieuwe kandidaat-genen die rol (len) kunnen spelen in het lot van de cel besluitvormingsprocessen die zich voordoen in subsets van het netvlies progenitorcellen ^8. Met een aantal eenvoudige aanpassingen aan het protocol, kan deze techniek worden gebruikt voor veel verschillende weefsels en celtypes.

Protocol

1. Cell Dissociatie Een stroomdiagram waarin het protocol wordt getoond is fig. 1. Voor de catalogusnummers van de specifieke reagentia gebruikt in dit protocol wordt verwezen naar tabel 1. Ontleden het netvlies in een PBS bad. Bij de dissectie is het best om het glasvocht en de lens te verwijderen omdat ze te houden met het netvlies kan belemmeren de dissociatie. Het is niet altijd een belangrijke vereiste voor alle retinale pigment (RPE) te verwijderen en in sommige gevalle…

Discussion

Een steeds groeiend aantal studies zijn onthullend robuuste cel-tot-cel variatie in populaties die werden geloofd om meer homogeen zijn met betrekking tot hun genexpressie ^6,8. In ten minste een geval, dit genexpressie "ruis" blijkt een belangrijke biologische functie ¹³ spelen. Genexpressie verschillen tussen individuele cellen worden verduisterd met behulp van traditionele gehele weefsel methoden. Deze experimenten genereren de expressie profiel van een "gemiddelde" cel, die m…

Materials

Reaction mixtures:

Cell Lysis buffer

0.45 μ	10X reaction buffer (100 mM Tris-HCl pH 8.3, 500 mM KCl, 2 mM MgCl2)
0.23 μl	10% NP-40
0.23 μl	0.1M DTT
0.05 μl	RNase Inhibitor (40 U/μl)
0.05 μl	SUPERase-In (20U/μl)
0.13 μl	Modified Oligo d(T) primer (TATAGAATTCGCGGCCGCTCGCGATTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT)
0.09 μl	dNTPs (2.5 mM each)
3.27 μl	dH20 (use molecular biology grade for all reaction mixtures)

Tailing Reaction Mixture

0.18 μl	100 mM dATP
0.6 μl	10X reaction buffer(100 mM Tris-HCl pH 8.3, 500 mM KCl, 2 mM MgCl2)
4.62 μl	dH2O
0.3 μl	TdT (400 U/μl)
0.3 μl	RNase H (2 U/μl)

PCR Reaction Mixture

10 μl	10x Ex-Taq HS Buffer with Mg2+
10 μl	2.5 mM dNTPs
0.2 μl	Modified Oligo d(T) primer (10 μg/μl)
1 μl	Ex-Taq HS Polymerase (5U/μl)
68.8 μl	dH2O

10X One-Phor All Buffer

0.5M	Potassium acetate
0.1M	Tris acetate (pH 7.6)
0.1M	Magnesium acetate

Solutions:

10X Phosphate buffered saline (1 liter)

80g NaCl
2g KCl
14.4 g Na₂PO₄
2.4 g KH₂PO₄
adjust to pH 7.4 with NaOH and bring the volume to 1 liter with water

Name of the reagent	Company	Catalog number	Comments
Vertical needle puller	David Kopf Instruments	Model 750
Microcapillary tubes	Sigma	P0674
Aspirator tube assembly	Sigma	A5177
Corning filter tips (100-1000 μl	Fisher Scientific	07-200-265
Hank’s balanced salt solution (1X)	Lonza BioWhittaker	10-508F
HEPES buffer (1M)	MP Biomedicals	091688449
Bovine serum albumin	Sigma	A9418
DNase I	Roche	04716728001
papain	Worthington	LS03126
Superscript III	Invitrogen	18080-044
RNase Inhibitor	Applied Biosystems	AM2682	These two RNase inhibitors seem to work the best. Contaminants present in other inhibitors can contribute to a background smear.
SUPERase-In	Applied Biosystems	AM2694	These two RNase inhibitors seem to work the best. Contaminants present in other inhibitors can contribute to a background smear.
Modified Oligo d(T) primer (gel purified)	Oligos ETC		We have used primers purchased from many different companies and have seen the most reliable and reproducible results from Oligos ETC.
T4 gene 32 protein	New England Biolabs	M0300L
Exonuclease I	New England Biolabs	M0293S
TdT	Roche	3 333 574	As with other reagents, using a TdT enzyme from other companies gave more variable results.
RNase H	Invitrogen	18021-014
Ex-Taq HS Polymerase	Takara	RR006A
Biotin N6-ddATP	Enzo Biosciences	42809

Table 1. Specific reagents and equipment.