מתא בודד פרופיל של נוירונים רשתית מתפתחות מבוגרים

Summary

שיטת בידוד של תאים ברשתית יחיד הגברה הבאות של cDNAs שלהם מתואר. מתא בודד transcriptomics מגלה את מידת ההטרוגניות הנוכחי הסלולר ברקמות ו חושף גנים סמן חדשים אוכלוסיות תאים נדירות. בפרוטוקול הנלווה יכול להיות מותאם כך שיתאים רבים סוגי תאים שונים.

Abstract

אוכלוסיות מאוד מיוחדים, אבל קטן מאוד של תאים ממלאים תפקידים חשובים ברקמות רבות. זיהוי תאים מסוג סמנים ספציפיים ביטוי הגן תוכניות תת תאים נדירים ביותר כבר אתגר משתמש רגיל כולו רקמות גישות. ביטוי גנים פרופיל של תאים בודדים מאפשר גישה חסרת תקדים סוגי תאים המרכיבים רק אחוז קטן של רקמה בסך הכל ^1-7. בנוסף, טכניקה זו ניתן להשתמש כדי לבחון את ביטוי הגן תוכניות באים לידי ביטוי זמני של מספר קטן של תאים במהלך מעברים התפתחותיים דינמיים ^8.

בעיה זו של גיוון הסלולר עולה שוב ושוב במערכת העצבים המרכזית (CNS) שבו קשרים עצביים יכול להתרחש בין תאים שונים לגמרי ^9. מספרם המדויק של תאים מסוגים שונים אינו ידוע במדויק, אך ההערכה היא כי ייתכנו כמה שרק 1000 סוגים שונים של קליפת המוח אניtself ^10. הפונקציה (ים) של מעגלים עצביים מורכבים יכול לסמוך על כמה סוגי נוירונים נדירים הגנים שהם מבטאים. על ידי זיהוי סמנים חדשים וסיוע מולקולרי לסווג נוירונים שונים, הגישה מתא בודד שימושית במיוחד בניתוח של סוגי תאים במערכת העצבים. היא עשויה גם לעזור להבהיר מנגנוני ההתפתחות העצבית על ידי זיהוי גנים לידי ביטוי באופן דיפרנציאלי ושבילים גנים במהלך בשלבים המוקדמים של הפיתוח אבי העצבית.

כמו רקמה, פשוט לגשת בקלות עם מגוון עצבי ניכר, חוליות הרשתית היא מערכת מודל מעולה ללימוד תהליכי פיתוח הסלולר, בידול עצבית גיוון עצבי. עם זאת, כמו בחלקים אחרים של מערכת העצבים המרכזית, זה הגיוון הסלולרי יכול להציג בעיה לקבוע את המסלולים הגנטיים המניעים אבות רשתית לאמץ גורל תאים ספציפיים, במיוחד לנוכח העובדה photoreceptors מוט לפצות את אמאjority של האוכלוסייה הכולל תא רשתית ^11. כאן אנו מדווחים על שיטה לזיהוי של תמלילי לידי ביטוי בתאי רשתית יחיד (איור 1). הטכניקה מתחיל מתא בודד פרופיל מאפשר הערכה של כמות הנוכחי הטרוגניות בתוך אוכלוסיות סלולריים שונים של הרשתית ^2,4,5,12. בנוסף, שיטה זו חשף שורה של גנים מועמדים חדשים אשר עשויים לשחק תפקיד (ים) את גורל התא תהליכי קבלת ההחלטות המתרחשים קבוצות משנה של ובתאים רשתית ^8. עם כמה שינויים פשוטים לפרוטוקול, טכניקה זו יכולה להיות מנוצל על רקמות שונות סוגי תאים.

Protocol

1. תא דיסוציאציה תרשים זרימה מתאר את הפרוטוקול הוא מוצג באיור 1. לקבלת מספרי קטלוג של חומרים כימיים מסוימים בשימוש בכל פרוטוקול זה, עיין בטבלה 1. לנתח את הרשתית באמבטיה PBS. במהלך הנתיחה, עדיף להסיר את הז…

Discussion

מספר המתרחבת של מחקרים חושפים שונות חזקים תא אל תא אוכלוסיות שנחשבו הומוגנית יותר מבחינת ביטוי הגנים שלהם ^6,8. לפחות במקרה אחד, ביטוי הגן הזה "רעש" הוכח לשחק תפקיד ביולוגי חשוב ^13. ביטוי גנים ההבדלים בין תאים בודדים הם הסתירו באמצעות מסורתיים כולו רקמות…

Materials

Reaction mixtures:

Cell Lysis buffer

0.45 μ	10X reaction buffer (100 mM Tris-HCl pH 8.3, 500 mM KCl, 2 mM MgCl2)
0.23 μl	10% NP-40
0.23 μl	0.1M DTT
0.05 μl	RNase Inhibitor (40 U/μl)
0.05 μl	SUPERase-In (20U/μl)
0.13 μl	Modified Oligo d(T) primer (TATAGAATTCGCGGCCGCTCGCGATTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT)
0.09 μl	dNTPs (2.5 mM each)
3.27 μl	dH20 (use molecular biology grade for all reaction mixtures)

Tailing Reaction Mixture

0.18 μl	100 mM dATP
0.6 μl	10X reaction buffer(100 mM Tris-HCl pH 8.3, 500 mM KCl, 2 mM MgCl2)
4.62 μl	dH2O
0.3 μl	TdT (400 U/μl)
0.3 μl	RNase H (2 U/μl)

PCR Reaction Mixture

10 μl	10x Ex-Taq HS Buffer with Mg2+
10 μl	2.5 mM dNTPs
0.2 μl	Modified Oligo d(T) primer (10 μg/μl)
1 μl	Ex-Taq HS Polymerase (5U/μl)
68.8 μl	dH2O

10X One-Phor All Buffer

0.5M	Potassium acetate
0.1M	Tris acetate (pH 7.6)
0.1M	Magnesium acetate

Solutions:

10X Phosphate buffered saline (1 liter)

80g NaCl
2g KCl
14.4 g Na₂PO₄
2.4 g KH₂PO₄
adjust to pH 7.4 with NaOH and bring the volume to 1 liter with water

Name of the reagent	Company	Catalog number	Comments
Vertical needle puller	David Kopf Instruments	Model 750
Microcapillary tubes	Sigma	P0674
Aspirator tube assembly	Sigma	A5177
Corning filter tips (100-1000 μl	Fisher Scientific	07-200-265
Hank’s balanced salt solution (1X)	Lonza BioWhittaker	10-508F
HEPES buffer (1M)	MP Biomedicals	091688449
Bovine serum albumin	Sigma	A9418
DNase I	Roche	04716728001
papain	Worthington	LS03126
Superscript III	Invitrogen	18080-044
RNase Inhibitor	Applied Biosystems	AM2682	These two RNase inhibitors seem to work the best. Contaminants present in other inhibitors can contribute to a background smear.
SUPERase-In	Applied Biosystems	AM2694	These two RNase inhibitors seem to work the best. Contaminants present in other inhibitors can contribute to a background smear.
Modified Oligo d(T) primer (gel purified)	Oligos ETC		We have used primers purchased from many different companies and have seen the most reliable and reproducible results from Oligos ETC.
T4 gene 32 protein	New England Biolabs	M0300L
Exonuclease I	New England Biolabs	M0293S
TdT	Roche	3 333 574	As with other reagents, using a TdT enzyme from other companies gave more variable results.
RNase H	Invitrogen	18021-014
Ex-Taq HS Polymerase	Takara	RR006A
Biotin N6-ddATP	Enzo Biosciences	42809

Table 1. Specific reagents and equipment.