在三维自组装多肽水凝胶的人类神经祖细胞的培养
Summary
在这里，我们描述了自组装的三维支架文化人类神经祖细胞的使用。我们提出了一个协议，以流式细胞仪分析后如释放支架的细胞。该协议可能会调整到其他类型的细胞，进行详细的机械研究。
Abstract
3维（3D）棚架上生长，增殖和最后的神经元分化的影响是极大的兴趣，以便找到细胞为基础的，规范化的治疗神经系统疾病或神经退行性疾病的新方法。预计三维结构提供了一个环境更接近体内的情况比2D文化。在再生医学的背景下，生物材料支架与神经干细胞和祖细胞的组合持有作为一种治疗工具的巨大潜力。1-5文化系统模拟三维环境的影响在不同类型的干细胞增殖和分化，并已被证明祖细胞。在这里，3D -微环境的形成和functionalisation重要的是要确定嵌入细胞的生存和命运。6-8在这里，我们用PuraMatrix 9,10（RADA16下午），基于一种多肽水凝胶支架，这是很好的描述和用于研究不同类型的细胞上的3D环境的影响。7,11-14 PuraMatrix可定制容易制造的纳米纤维的合成提供了一个高可靠性的三维培养体系，这此外，异种自由。
最近，我们研究形成的脚手架上的PM浓度的影响，在这项研究中13 PM的使用浓度上形成的三维结构，这是由原子力显微镜表明了直接影响。一个随后的生存和分化的hNPCs分析显示嵌入式细胞的命运时所使用的浓度的影响。然而，生存或免疫荧光技术具有一些障碍，神经元分化的分析。为了获得可靠的数据，来判断一个矩阵内的细胞总数获得的相对数，如。 βIII-微管蛋白标记的神经细胞。这是先决条件的技术来分析，共聚焦显微镜或荧光显微镜能够采取标本Z -栈一样可比技术在所有3个维度的支架。此外，这种分析是极其耗费时间。
在这里，我们展示了一个方法，为以后的分析，如流式细胞仪从三维棚架细胞释放。在这个协议中培养人类神经祖细胞ReNcell VM细胞株（hNPCs）（美国Millipore公司），并在三维支架组成PuraMatrix（下午）或与层粘连蛋白（PML）的补充PuraMatrix有区别的。在我们的手上了0.25％的PM浓度是最适合培养细胞 13，但浓度可能会调整到其他类型的细胞。12可用于释放的细胞如免疫细胞化学研究，并随后通过流式细胞仪分析。这加快了分析和Mo重新结束后，获得的数据的其余部分更广泛的基础，提高数据的可靠性。
Protocol
Discussion
使用三维支架提供学习的机会，发展不同类型的细胞在细胞培养的情况下更接近体内的情况。然而，就如神经元分化或功能的研究，人们必须克服一些障碍，以获得可靠的数据类型的细胞，例如量化分析。
在这里，我们描述了基于脚手架PuraMatrix，并随后在2D情况，流式细胞仪或功能分析提供一个易于访问工具的研究使用的细胞释放的多肽水凝胶的hNPCs文化。最近，我们…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
作者想感谢他出色的技术支持，克鲁格诺曼。
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| PuraMatrix peptide hydrogel | BD Bioscience | 354250 | |
| Mouse laminin I | Cultrex | 400-2009090 | |
| Sucrose | Sigma | S9378-1KG | |
| Normal goat serum | Dako | X0907 | |
| Triton X 100 | Roth | 3051.3 | |
| PBS Dulbecco | Biochrom AG | L 1825 | |
| HBSS | Gibco | 14170-088 | Hanks’ Balanced Salt Solution 1X |
| βIII-tubulin antibody | Santa Cruz | Sc-51670 | Mouse, monoclonal, 1:500 |
| Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A 11029 | Goat α mouse, 1:1000 |
| Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A 11031 | Goat α mouse, 1:1000 |
| Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A 21235 | Goat α mouse, 1:1000 |
| Mowiol 4-88 Reagent | Calbiochem | 475904 | |
| Dabco | Aldrich | D2,780-2 | 1,4-Diazabicyclo[2.2.2]octane 98% |
| Cell strainer | BD Biosciences | 352350 | 70 μm pore size |
| Saponin | Merck | 7695 | |
| Trypsin/ EDTA | GIBCO | 25300-054 | |
| Benzonase 250 U/μl | Merck | 1.01654.0001 | |
| Trypsin Inhibitor | Sigma | T6522 (500 mg) | |
| 20% HSA | Octapharma | Human-Albumin Kabi 20% |
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