Cultivo de células progenitoras neurais em um hidrogel Peptide 3-dimensional de auto-montagem

Resumo

Aqui nós descrevemos o uso de uma auto-montagem 3-dimensional andaime para a cultura humana células progenitoras neurais. Nós apresentamos um protocolo para liberar as células da scaffolds a serem analisados ​​posteriormente por exemplo, por citometria de fluxo. Este protocolo pode ser adaptado para outros tipos de células para realizar estudos detalhados mecanicamente.

Resumo

A influência de três dimensões (3D) andaimes em diferenciação, proliferação, crescimento e finalmente neuronal é de grande interesse, a fim de encontrar novos métodos de terapias baseadas em células e padronizado em distúrbios neurológicos ou doenças neurodegenerativas. Estruturas 3D são esperados para proporcionar um ambiente muito mais próximo da situação in vivo do que as culturas 2D. No contexto da medicina regenerativa, a combinação de andaimes biomaterial com tronco neurais e células progenitoras é uma grande promessa como uma ferramenta terapêutica. ^1-5 sistemas Cultura emular um ambiente tridimensional foram mostrados para influenciar a proliferação e diferenciação em diferentes tipos de caule e células progenitoras. Aqui, a formação e funcionalização do 3D microenviroment é importante para determinar a sobrevivência e destino das células incorporado. ^6-8 Aqui usamos PuraMatrix ^9,10 (RADA16, PM), um peptídeo com base hidrogel andaime,que é bem descrito e utilizado para estudar a influência de um ambiente 3D sobre diferentes tipos celulares. ^7,11-14 PuraMatrix podem ser facilmente personalizados ea fabricação sintética do nano-fibras fornece um sistema de cultura 3D de alta confiabilidade, que é, além xeno-free.

Recentemente, têm estudado a influência da concentração de PM-sobre a formação do andaime. ¹³ Neste estudo as concentrações utilizadas da PM teve um impacto direto sobre a formação da estrutura em 3D, que foi demonstrada por microscopia de força atômica. Uma análise posterior da sobrevivência e diferenciação dos hNPCs revelou uma influência das concentrações utilizadas da PM sobre o destino das células incorporado. No entanto, a análise de sobrevida ou diferenciação neuronal por meio de técnicas de imunofluorescência possuir alguns obstáculos. Para obter dados confiáveis, é preciso determinar o número total de células dentro de uma matriz para obter o número relativo de exemplo. células neuronais marcados por βIII-tubulina. Este pré-requisitos de uma técnica para analisar os andaimes em todas as dimensões de 3 por um microscópio confocal ou uma técnica comparável como microscópios de fluorescência capaz de tomar z-stacks da amostra. Além disso, este tipo de análise é extremamente demorado.

Aqui demonstramos um método para liberar as células dos andaimes 3D para a análise posterior por exemplo, por citometria de fluxo. Neste protocolo células progenitoras neurais (hNPCs) da linha celular ReNcell VM (Millipore EUA) foram cultivadas e diferenciadas em 3D-scaffolds consistindo de PuraMatrix (PM) ou PuraMatrix suplementado com laminina (PML). Em nossas mãos um PM-concentração de 0,25% foi ideal para o cultivo das ¹³ células, no entanto, a concentração pode ser adaptado para outros tipos celulares. ¹² As células liberado pode ser usado para, por exemplo estudos imunocitoquímicos e posteriormente analisadas por citometria de fluxo. Isso acelera a análise e more mais, o resto os dados obtidos sobre uma base mais ampla, melhorando a confiabilidade dos dados.

Protocolo

1. Parte 1: Cultura da hNPCs em PuraMatrix

1. Com antecedência, para a geração de um andaime com uma concentração de 0,25% PuraMatrix sem laminina, é necessário preparar as seguintes soluções
2. Prepare uma solução contendo sacarose 20% e uma solução contendo 10% de sacarose dissolvida em água destilada estéril.
3. Para solução 1 ml mix 120 da solução de sacarose 20% com 120 mL de água destilada em um tubo de 1,5 ml cônico.
4. Para a solução 2 mL mix 60 do PuraMatrix solução com 60 ml de solução de sacarose 20% em um tubo de 1,5 ml cônico.

De uma preparação de um andaime com uma concentração de 0,25% Pur....

Discussão

O uso do 3D-scaffolds oferece a oportunidade de estudar o desenvolvimento de diferentes tipos de células em uma situação de cultura de células mais perto a situação in vivo. No entanto, quanto à análise da diferenciação neuronal por exemplo, ou estudos funcionais é preciso superar alguns obstáculos para obtenção de dados confiáveis ​​para quantificação por exemplo, de tipos de células.

Aqui descrevemos a cultura de hNPCs no hidrogel baseada peptídeo scaffold PuraMatrix e po.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Nome do reagente	Companhia	Número de catálogo	Comentários
PuraMatrix hidrogel peptídeo	BD Bioscience	354250
Rato laminina I	Cultrex	400-2009090
Sacarose	Sigma	S9378-1KG
Soro normal de cabra	Dako	X0907
Triton X 100	Roth	3051,3
PBS Dulbecco	Biochrom AG	L 1825
HBSS	Gibco	14170-088	Solução de Hanks salina balanceada 1X
Anticorpo βIII-tubulina	Santa Cruz	Sc-51670	Mouse, monoclonal, 1:500
Alexa Fluor 488	Invitrogen	A 11.029	Cabra α mouse, 1:1000
Alexa Fluor 568	Invitrogen	A 11.031	Cabra α mouse, 1:1000
Alexa Fluor 647	Invitrogen	A 21.235	Cabra α mouse, 1:1000
Mowiol Reagente 4-88	Calbiochem	475904
Dabco	Aldrich	D2 ,780-2	1,4-diazabiciclo [2.2.2] octano 98%
Coador celular	BD Biosciences	352350	70 mM tamanho dos poros
Saponina	Merck	7695
Tripsina/ EDTA	GIBCO	25300-054
Benzonase 250 U / mL	Merck	1.01654.0001
Inibidor de tripsina	Sigma	T6522 (500 mg)
20% HSA	Octapharma	A albumina humana-Kabi 20%