La culture de cellules progénitrices neurales humaines dans un hydrogel en 3 dimensions Peptide auto-assemblage
Summary
Nous décrivons ici l'utilisation d'un auto-assemblage en 3 dimensions d'échafaudage à la culture humaine cellules progénitrices neurales. Nous présentons un protocole visant à libérer les cellules de la échafaudages pour être analysés ultérieurement, par exemple par cytométrie en flux. Ce protocole pourrait être adapté à d'autres types cellulaires pour effectuer des études détaillées de façon mécaniste.
Abstract
L'influence des trois dimensions (3D) des échafaudages sur la différenciation de croissance, la prolifération neuronale et finalement un grand intérêt dans le but de trouver de nouvelles méthodes pour les thérapies cellulaires et standardisée dans les troubles neurologiques ou de maladies neurodégénératives. Structures 3D sont censés fournir un environnement beaucoup plus proche de la situation in vivo que les cultures en 2D. Dans le contexte de la médecine régénérative, la combinaison des échafaudages biomatériau souches neurales et de cellules progénitrices est très prometteur comme outil thérapeutique. 1-5 Systèmes de culture émuler un environnement en trois dimensions a été démontré que l'influence la prolifération et la différenciation dans les différents types de souches et cellules progénitrices. Ici, la formation et la fonctionnalisation de la 3D-microenviroment est important de déterminer la survie et le devenir des cellules intégrées 6-8. Ici nous avons utilisé PuraMatrix 9,10 (RADA16, PM), un peptide hydrogel à base d'échafaudage,ce qui est bien décrite et utilisée pour étudier l'influence d'un environnement en 3D sur différents types cellulaires. 7,11-14 PuraMatrix peut être personnalisé facilement et la fabrication synthétique de la nano-fibres fournit un système de culture 3D de haute fiabilité, qui est en outre xéno-libres.
Récemment, nous avons étudié l'influence de la concentration en PM-sur la formation de l'échafaud. 13 Dans cette étude, les concentrations de PM utilisés ont eu un impact direct sur la formation de la structure 3D, qui a été démontré par microscopie à force atomique. Une analyse ultérieure de la survie et la différenciation des hNPCs révélé une influence des concentrations de PM utilisés sur le sort des cellules embarquées. Cependant, l'analyse de la survie ou la différenciation neuronale par des techniques d'immunofluorescence posséder quelques obstacles. Pour obtenir des données fiables, on doit déterminer le nombre total de cellules dans une matrice afin d'obtenir le nombre relatif de par exemple. cellules neuronales marquée par βIII-tubuline. Ce prérequis d'une technique pour analyser les échafaudages dans toutes les dimensions de 3 par un microscope confocal ou une technique comparable, comme des microscopes à fluorescence en mesure de prendre z-piles de l'échantillon. En outre, ce type d'analyse est beaucoup de temps.
Ici nous démontrons une méthode pour libérer les cellules de la échafaudages 3D pour l'analyse ultérieure, par exemple par cytométrie en flux. Dans ce protocole humains cellules progénitrices neurales (hNPCs) de la ligne de cellules ReNcell VM (Millipore Etats-Unis) ont été cultivées et différenciées en 3D composé d'échafaudages PuraMatrix (PM) ou PuraMatrix complétée par la laminine (LEMP). Dans nos mains un PM-concentration de 0,25% a été optimale pour la culture des 13 cellules, cependant l'opération pourrait être adapté à d'autres types cellulaires. 12 Les cellules libérées peuvent être utilisées par exemple pour des études immunocytochimiques et ensuite analysés par cytométrie en flux. Cela accélère l'analyse et la more plus, le reste des données obtenues sur une base plus large, l'amélioration de la fiabilité des données.
Protocol
Discussion
L'utilisation de la 3D-échafaudages offre l'opportunité d'étudier le développement de différents types de cellules dans une situation de culture cellulaire plus proche de la situation in vivo. Toutefois, concernant l'analyse de la différenciation neuronale par exemple ou des études fonctionnelles on doit surmonter certains obstacles pour obtenir des données fiables pour la quantification, par exemple des types de cellules.
Ici, nous décrit la cultur…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs tiennent à remercier Norman Krüger pour son excellent support technique.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| PuraMatrix peptide hydrogel | BD Bioscience | 354250 | |
| Mouse laminin I | Cultrex | 400-2009090 | |
| Sucrose | Sigma | S9378-1KG | |
| Normal goat serum | Dako | X0907 | |
| Triton X 100 | Roth | 3051.3 | |
| PBS Dulbecco | Biochrom AG | L 1825 | |
| HBSS | Gibco | 14170-088 | Hanks’ Balanced Salt Solution 1X |
| βIII-tubulin antibody | Santa Cruz | Sc-51670 | Mouse, monoclonal, 1:500 |
| Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A 11029 | Goat α mouse, 1:1000 |
| Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A 11031 | Goat α mouse, 1:1000 |
| Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A 21235 | Goat α mouse, 1:1000 |
| Mowiol 4-88 Reagent | Calbiochem | 475904 | |
| Dabco | Aldrich | D2,780-2 | 1,4-Diazabicyclo[2.2.2]octane 98% |
| Cell strainer | BD Biosciences | 352350 | 70 μm pore size |
| Saponin | Merck | 7695 | |
| Trypsin/ EDTA | GIBCO | 25300-054 | |
| Benzonase 250 U/μl | Merck | 1.01654.0001 | |
| Trypsin Inhibitor | Sigma | T6522 (500 mg) | |
| 20% HSA | Octapharma | Human-Albumin Kabi 20% |
Referências
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