Summary
Den ECIS / Taxis system er en automatisert, real-time metode som måler mobilnettet chemotaxis. I denne analysen, celler flytte under et lag av agarose å komme fram til et mål elektrode. Cellular bevegelse måles ved utbruddet av motstand mot vekselstrøm 0.
Abstract
Cellular bevegelse i respons til ytre stimuli er grunnleggende for mange cellulære prosesser inkludert sårtilheling, betennelser og responsen på infeksjon. En vanlig metode for å måle chemotaxis er Boyden kammeret analysen, der celler og chemoattractant er atskilt med en porøs membran. Som cellene vandrer gjennom membranen mot chemoattractant, overholde de til undersiden av membranen, eller falle inn i de underliggende media, og blir deretter farges og visuelt telles en. I denne metoden, er celler utsatt for en bratt og forbigående chemoattractant gradient, som antas å være en dårlig representasjon av gradienter i vev 2.
En annen assay system, under agarose chemotaxis analysen, 3, 4 tiltak celle bevegelse over et solid underlag i en tynn vandig film som danner under agarose laget. Stigningen som utvikler i agarose er grunne og er tenkt å være en appropriate representasjon av naturlig forekommende gradienter. Chemotaxis kan evalueres ved mikroskopisk avbildning av distanse. Både Boyden kammeret analysen og under agarose analysen er vanligvis konfigurert som endepunkt analyser.
Den automatiserte ECIS / Taxis system kombinerer under agarose tilnærming med Electric Cell-substrat impedans Sensing (ECIS) 5, 6. I denne analysen, er målet elektroder plassert i hver av 8 kamre. En stor counter-elektrode går gjennom hver av de 8 Chambers (figur 2). Hvert kammer er fylt med agarose og to små brønner er kutt i agarose på hver side av målet elektroden. En brønn er fylt med testen cellen befolkningen, mens den andre holder kildene spre chemoattractant (figur 3). Gjeldende passerte gjennom systemet kan brukes til å bestemme endringen i motstand som oppstår som cellene passerer over målet elektroden. Celler på målet electrode øke motstanden av systemet seks. I tillegg raske svingninger i motstanden representerer endringer i samspillet av celler med elektroden overflaten og indikerer pågående mobilnettet form endres. Den ECIS / Taxis system kan måle bevegelse av cellen befolkningen i sanntid over lengre tid, men er også følsom nok til å oppdage ankomsten av en enkelt celle på målet elektroden.
Dictyostelium discoidium er kjent for å migrere i nærvær av en folat 7 gradient, 8 og dens kjemotaktisk respons kan måles nøyaktig ved ECIS / Taxis 9. Leukocytter chemotaxis, har som svar på SDF1α og chemotaxis antagonister også blitt målt med ECIS / 10 Taxis, 11. Et eksempel på leukocytt respons på SDF1α er vist i Figur 1.
Protocol
Discussion
Novel egenskaper ECIS / Taxis analysen inkluderer evnen til å automatisere innsamling av sanntidsdata som celler reagerer på chemoattractant. Mens det mest vanlig anvendelse av denne teknologien er å måle cellulære responser til individuelle kjemotaktisk gradienter, eller gradienter som består av blandinger av chemotaxis agonister og antagonister, er det ECIS / Taxis tilnærming også mottagelig for variasjoner i disse konfigurasjonene som kan være ganske nyttig i vurdering av cellulær respons. Det er god dokume…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra National Institutes of Health (ES07408 og EB00208).
Materials
| Name of Reagent | Company | Catalog number | Comments |
| ECIS Zθ | Applied Biophysics | http://www.biophysics.com/prodducts_Ecisz0.php | |
| ECIS Electrode Array | Applied Biophysics | 8W Chemotaxis | http://www.biophysics.com/cultureware.php |
| Seakem GTG agarose | BioWhittaker Molecular Applications | 50070 | |
| RPMI1640 | Cellgro | 10-040 | |
| HyClone Fetal Bovine Serum | Thermo Scientific | SH300703 | |
| Penicillin/Streptomycin | MP Biomedicals | 1670049 | Penicillin 5,000 IU/ml; Streptomycin 5 mg/ml |
| HEPES Buffer | MP Biomedicals | 1688449 | 1M solution, cell culture grade |
| 14 Gauge stainless steel Cannula (2) 4 inch | General Laboratory Supply | 5-8365-1 | Blunt point |
Referências
- Boyden, S. The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes. J. Exp. Med. 115, 453-466 (1962).
- Lauffenburger, D. A., Tranquillo, R. T., Zigmond, S. H. Concentration gradients of chemotactic factors in chemotaxis assays. Methods Enzymol. 162, 85-101 (1988).
- Nelson, R. D., Quie, P. G., Simmons, R. L. Chemotaxis under agarose: a new and simple method for measuring chemotaxis and spontaneous migration of human polymorphonuclear leukocytes and monocytes. J. Immunol. 115, 1650-1650 (1975).
- Newton-Nash, D. K., Tonellato, P., Swiersz, M., Abramoff, P. Assessment of chemokinetic behavior of inflammatory lung macrophages in a linear under-agarose assay. J. Leukoc. Biol. 48, 297-305 (1990).
- Giaever, I., Keese, C. R. Monitoring fibroblast behavior in tissue culture with an applied electric field. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81, 3761-374 (1984).
- Keese, C. G. I. A Whole Cell Biosensor bsed on Cell-Substrate Interactions. IEEE Engineering in Medicine and Biology Society. 12, 500-501 (1990).
- Laevsky, G., Knecht, D. A. Cross-linking of actin filaments by myosin II is a major contributor to cortical integrity and cell motility in restrictive environments. J. Cell. Sci. 116, 3761-3770 (2003).
- Condeelis, J., Bresnick, A., Demma, M., Dharmawardhane, S., Eddy, R., Hall, A. L., Sauterer, R., Warren, V. Mechanisms of amoeboid chemotaxis: an evaluation of the cortical expansion. 11, 5-6 (1990).
- Hadjout, N., Laevsky, G., Knecht, D. A., Lynes, M. A. Automated real-time measurement of chemotactic cell motility. Biotechniques. 31, 1130-1138 (2001).
- Hadjout, N., Yin, X., Knecht, D. A., Lynes, M. A. Automated real-time measurements of leukocyte chemotaxis. J. Immunol. Methods. 320, 70-80 (2007).
- Yin, X., Knecht, D. A., Lynes, M. A. Metallothionein mediates leukocyte chemotaxis. BMC Immunol. 6, 21-21 (2005).
- Lundien, M. C., Mohammed, K. A., Nasreen, N., Tepper, R. S., Hardwick, J. A., Sanders, K. L., Van Horn, R. D., Antony, V. B. Induction of MCP-1 expression in airway epithelial cells: role of CCR2 receptor in airway epithelial injury. J. Clin. Immunol. 22, 144-152 (2002).
- Zudaire, E., Cuesta, N., Murty, V. The aryl hydrocarbon receptor repressor is a putative tumor suppressor gene in multiple human cancers. J. Clin. Invest. 118, 640-650 (2008).
- Opp, D., Wafula, B., Lim, J., Huang, E., Lo, J. C., Lo, C. M. Use of electric cell-substrate impedance sensing to assess in vitro cytotoxicity. Biosens. Bioelectron. 24, 2625-269 (2009).
- Foxman, E. F., Kunkel, E. J., Butcher, E. C. Integrating conflicting chemotactic signals. The role of memory in leukocyte navigation. J. Cell. Biol. 147, 577-588 (1999).
- Heit, B., Tavener, S., Raharjo, E., Kubes, P. An intracellular signaling hierarchy determines direction of migration in opposing chemotactic gradients. J. Cell. Biol. 159, 91-102 (1999).
