Summary
Den ECIS / Taxa system er en automatiseret, real-time analyse, der måler cellulære kemotaksi. I dette assay flytte cellerne under et lag af agarose at nå frem til et mål elektrode. Cellulær bevægelse måles ved indtræden af resistens over for vekselstrøm 0.
Abstract
Cellulære bevægelse som reaktion på ydre stimuli er afgørende for mange cellulære processer, herunder sårheling, inflammation og respons på infektion. En almindelig metode til at måle kemotaksi er Boyden kammer assay, i hvilket celler og kemotiltrækkende er adskilt af en porøs membran. Som celler migrerer gennem membranen mod det kemotiltrækkende de klæber til undersiden af membranen eller kan opdeles i de underliggende mediet, og efterfølgende farvet og visuelt tælles 1. Ved denne fremgangsmåde celler eksponeres for en stejl og transient kemoattraktant gradient, hvilket menes at være en dårlig gengivelse af gradienter, der findes i væv to.
Et andet assaysystem, under-agarose-kemotaxi-assay, 3, 4 foranstaltninger cellebevægelse over et fast substrat med en tynd vandig film, der dannes under agarose lag. Den gradient, der udvikler i agarose er lavvandet, og menes at være en appropriate repræsentation af naturligt forekommende gradienter. Kemotaksi kan vurderes ved mikroskopisk afbildning af den tilbagelagte afstand. Både Boyden-kammer-assayet og under-agarose assay sædvanligvis udformet som slutpunkt assays.
Den automatiserede ECIS / Taxa system kombinerer under-agarose tilgang med Electric Cell-substrat Impedans Sensing (ECIS) 5, 6. I dette assay, er target elektroder placeret i hver af 8 kamre. En stor modelektrode løber gennem hver af de 8 kamre (figur 2). Hvert kammer er fyldt med agarose og to små brønde er snit i agarosen på hver side af målet elektroden. En brønd fyldes med prøven cellepopulation, medens den anden holder kilder spredende kemoattraktant (figur 3). Strøm ledes gennem systemet kan anvendes til at bestemme ændringen i modstand, der opstår som celler passerer hen over mål-elektroden. Celler på målet electrode forøge modstandsdygtigheden af systemet 6. Desuden udgør hurtige fluktuationer i modstanden ændringer i interaktioner af celler med elektrodeoverfladen og er indikative for løbende cellulære formændringer. Den ECIS / Taxis system kan måle bevægelsen af cellepopulationen i real-tid over længere tid, men er også følsom nok til at detektere ankomsten af en enkelt celle ved målet elektroden.
Dictyostelium discoidium vides at migrere i nærvær af en folat gradient 7, 8 og kemotaktiske respons kan måles nøjagtigt ved ECIS / Taxis 9. Leukocytkemotaxis, har som reaktion på SDF1α og kemotaxi antagonister også blevet målt med ECIS / Taxis 10, 11. Et eksempel på leukocyt respons på SDF1α er vist i fig 1.
Protocol
Discussion
Nye egenskaber ECIS / Taxis analysen omfatter dens evne til at automatisere indsamling af data i realtid, som cellerne reagerer på chemoattraktant. Mens den mest almindelige anvendelse af denne teknologi er at måle cellulære responser til individuelle kemotaktiske gradienter eller gradienter sammensat af blandinger af kemotaksi agonister og antagonister, til ECIS / taxier fremgangsmåde er også egnet til variationer af disse konfigurationer, som kan være ganske nyttige i Vurderingen af cellulær respons. Der …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af tilskud fra National Institutes of Health (ES07408 og EB00208).
Materials
| Name of Reagent | Company | Catalog number | Comments |
| ECIS Zθ | Applied Biophysics | http://www.biophysics.com/prodducts_Ecisz0.php | |
| ECIS Electrode Array | Applied Biophysics | 8W Chemotaxis | http://www.biophysics.com/cultureware.php |
| Seakem GTG agarose | BioWhittaker Molecular Applications | 50070 | |
| RPMI1640 | Cellgro | 10-040 | |
| HyClone Fetal Bovine Serum | Thermo Scientific | SH300703 | |
| Penicillin/Streptomycin | MP Biomedicals | 1670049 | Penicillin 5,000 IU/ml; Streptomycin 5 mg/ml |
| HEPES Buffer | MP Biomedicals | 1688449 | 1M solution, cell culture grade |
| 14 Gauge stainless steel Cannula (2) 4 inch | General Laboratory Supply | 5-8365-1 | Blunt point |
Referências
- Boyden, S. The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes. J. Exp. Med. 115, 453-466 (1962).
- Lauffenburger, D. A., Tranquillo, R. T., Zigmond, S. H. Concentration gradients of chemotactic factors in chemotaxis assays. Methods Enzymol. 162, 85-101 (1988).
- Nelson, R. D., Quie, P. G., Simmons, R. L. Chemotaxis under agarose: a new and simple method for measuring chemotaxis and spontaneous migration of human polymorphonuclear leukocytes and monocytes. J. Immunol. 115, 1650-1650 (1975).
- Newton-Nash, D. K., Tonellato, P., Swiersz, M., Abramoff, P. Assessment of chemokinetic behavior of inflammatory lung macrophages in a linear under-agarose assay. J. Leukoc. Biol. 48, 297-305 (1990).
- Giaever, I., Keese, C. R. Monitoring fibroblast behavior in tissue culture with an applied electric field. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81, 3761-374 (1984).
- Keese, C. G. I. A Whole Cell Biosensor bsed on Cell-Substrate Interactions. IEEE Engineering in Medicine and Biology Society. 12, 500-501 (1990).
- Laevsky, G., Knecht, D. A. Cross-linking of actin filaments by myosin II is a major contributor to cortical integrity and cell motility in restrictive environments. J. Cell. Sci. 116, 3761-3770 (2003).
- Condeelis, J., Bresnick, A., Demma, M., Dharmawardhane, S., Eddy, R., Hall, A. L., Sauterer, R., Warren, V. Mechanisms of amoeboid chemotaxis: an evaluation of the cortical expansion. 11, 5-6 (1990).
- Hadjout, N., Laevsky, G., Knecht, D. A., Lynes, M. A. Automated real-time measurement of chemotactic cell motility. Biotechniques. 31, 1130-1138 (2001).
- Hadjout, N., Yin, X., Knecht, D. A., Lynes, M. A. Automated real-time measurements of leukocyte chemotaxis. J. Immunol. Methods. 320, 70-80 (2007).
- Yin, X., Knecht, D. A., Lynes, M. A. Metallothionein mediates leukocyte chemotaxis. BMC Immunol. 6, 21-21 (2005).
- Lundien, M. C., Mohammed, K. A., Nasreen, N., Tepper, R. S., Hardwick, J. A., Sanders, K. L., Van Horn, R. D., Antony, V. B. Induction of MCP-1 expression in airway epithelial cells: role of CCR2 receptor in airway epithelial injury. J. Clin. Immunol. 22, 144-152 (2002).
- Zudaire, E., Cuesta, N., Murty, V. The aryl hydrocarbon receptor repressor is a putative tumor suppressor gene in multiple human cancers. J. Clin. Invest. 118, 640-650 (2008).
- Opp, D., Wafula, B., Lim, J., Huang, E., Lo, J. C., Lo, C. M. Use of electric cell-substrate impedance sensing to assess in vitro cytotoxicity. Biosens. Bioelectron. 24, 2625-269 (2009).
- Foxman, E. F., Kunkel, E. J., Butcher, E. C. Integrating conflicting chemotactic signals. The role of memory in leukocyte navigation. J. Cell. Biol. 147, 577-588 (1999).
- Heit, B., Tavener, S., Raharjo, E., Kubes, P. An intracellular signaling hierarchy determines direction of migration in opposing chemotactic gradients. J. Cell. Biol. 159, 91-102 (1999).
