多光子显微镜的清除小鼠脑组织表达YFP
Summary
整个小鼠脏器的多光子显微镜能够通过光学成像之前清零器官，但并非所有协议保留的荧光蛋白的荧光信号。使用光学乙醇脱水和苯甲醇苯甲酸苄酯结算的结算方法，显示高分辨率的多光子图像的整个小鼠脑组织表达YFP。
Abstract
多光子显微镜是通过光学成像之前清除器官的固有荧光和二次谐波产生（SHG）的整个鼠标机关。1,2然而，对于器官，包含荧光蛋白，如GFP和YFP，光使用甲醇的结算协议脱水和用苄醇苯甲酸苄酯（巴布），而未受保护的光3不保留的荧光信号。这里介绍的是一种新的方式，同时保留YFP的荧光信号在神经元中表达，在其中执行整个器官对小鼠脑组织的光透明的协议。改变光透明的协议，例如使用的乙醇梯度系列已经发现，减少损伤的荧光蛋白，并保持其多光子成像的荧光信号，器官是脱水。4使用一个优化的方法，光透明的基于乙醇的脱水和清除由巴布从光屏蔽时，我们显示高分辨率的多光子图像，黄色荧光蛋白（YFP）表达在神经元的小鼠脑组织表面下方超过2毫米。
Protocol
1。动物灌注5和整个小鼠脑结算的整个长度上的程序可以根据每脱水工序中使用的时间长度而变化，但总的整个过程可以在两天内进行。 称重YFP的小鼠和然后深深麻醉腹膜内注射氯胺酮/赛拉嗪（100毫克/公斤10毫克/公斤）。 确认的手术平面的深度麻醉，然后再进行手术。检查动物，每隔5分钟，看看它的反应到公司或脚趾尾捏。如果动物的反应，氯胺酮/赛拉嗪的补充?…
Discussion
虽然标准的有机染料是兼容的有机溶剂的范围内，因此，不清除协议构成特别的挑战，荧光蛋白往往是在溶剂中的改变的耐性低。4本工作的目的是克服一个严重的限制以前的光学结算协议XFPS荧光的丢失或严重退化。这里所呈现的图像表明，荧光YFP被保存。光透明这里描述的技术允许YFP标记的神经元在长达2毫米的整个鼠脑组织表面下的高清晰度成像。先前证明，使用乙醇脱水，也将保留?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们要感谢他的援助，在视频编辑雅各索利斯。
这部分工作是由美国国家科学基金会职业奖DBI-0953902 MJ列文。
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalog number | Comments |
| Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich, Inc. | D8537 | 500 ml, pH 7.2 |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | 10 x 10 ml, 16% paraformaldehyde |
| Ethyl alcohol | American Bioanalytical | AB00515-00500 | 500 ml, 200 proof |
| Ethyl alcohol | Pharmco Products, Inc. | 111000190 | 1 gal., 190 proof |
| Benzyl alcohol | Sigma-Aldrich, Inc. | 402834 | 500 ml, 99+% |
| Benzyl benzoate | Sigma-Aldrich, Inc. | B6630-IL | 500 ml, ≥ 99% |
| 5X/0.5 NA objective | Nikon | AZ Plan Flour 5X | 15 WD |
Referências
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Citar este artigo
Parra, S. G., Vesuna, S. S., Murray, T. A., Levene, M. J. Multiphoton Microscopy of Cleared Mouse Brain Expressing YFP. J. Vis. Exp. (67), e3848, doi:10.3791/3848 (2012).