चीर चिप के माध्यम से शाही सेना जुड़े परिसरों को अलग और पहचान के लिए कदम प्रोटोकॉल द्वारा एक कदम है.
उच्च throughput अनुक्रमण और कुशल माइक्रोएरे विश्लेषण के विकास का एक परिणाम के रूप में, वैश्विक जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण डेटा संग्रह का एक आसान और आसानी से उपलब्ध फार्म बन गया है. कई शोध और रोग मॉडल लेकिन, लक्ष्य जीन mRNA की स्थिर राज्य स्तर हमेशा स्थिर राज्य प्रोटीन के स्तर के साथ सीधे सहसंबंधी नहीं करता है. पोस्ट ट्रांस्क्रिप्शनल जीन विनियमन दोनों के बीच अंतर के एक संभावना विवरण है. आरएनए बंधनकारी प्रोटीन (RBP) के बंधन से प्रेरित है, के बाद transcriptional विनियमन (RNP) लक्ष्य mRNAs के साथ Ribonucleoprotein जटिल द्वारा निर्मित mRNA स्थानीयकरण, स्थिरता और अनुवाद को प्रभावित करता है. RNP परिसर में सेलुलर अर्क से इन अज्ञात डी Novo mRNA लक्ष्य की पहचान समझ तंत्र और RBP और उनके प्रोटीन उत्पादन पर परिणामी प्रभाव के कार्यों के लिए निर्णायक है. इस प्रोटोकॉल में एक विधि करार दिया immunoprecipitation (आरआईपी चिप) माइक्रोएरे, RNP जो एस के पहचान के लिए अनुमति देता है की रूपरेखाpecific mRNAs ribonucleoprotein परिसर में जुड़े, बदलते प्रयोगात्मक शर्तों के तहत, विकल्प के साथ आगे व्यक्ति शोधकर्ता के लिए एक प्रयोग का अनुकूलन. इस महत्वपूर्ण प्रायोगिक उपकरण के साथ, शोधकर्ताओं ने जटिल बाद ट्रांस्क्रिप्शनल जीन के रूप में के रूप में अच्छी तरह से विनियमन अन्य ribonucleoprotein बातचीत के साथ जुड़े तंत्र का पता लगाने कर सकते हैं.
इस प्रयोग, अनुकूलन, और अनुभव की प्रकृति के कारण केवल गारंटी करने के लिए सफलतापूर्वक इच्छित परिणाम प्राप्त करने के तरीके का हो जाएगा. इस प्रक्रिया के कई चरणों में, तापमान और अभिकर्मकों और उत्पादों के कुशल से निपटने के गंभीर रूप से महत्वपूर्ण हैं. उचित योजना और तकनीक के निष्पादन में मदद मिलेगी बीमा है कि प्रयोग इष्टतम सिफारिश तापमान पर एक उचित समय सीमा में प्रदर्शन किया गया था. शाही सेना अलगाव प्रयोगों के साथ एक प्रमुख मुद्दा RNAs के RNases गिरावट के लिए संवेदनशीलता है. सभी अभिकर्मकों RNase मुक्त और संग्रहीत या RNase मुक्त कंटेनरों में इस्तेमाल होने की जरूरत है. यह अपनी mRNA नमूना की अखंडता को सुनिश्चित करने में एक महत्वपूर्ण कदम है. यहां तक कि जब प्रयोग ठीक से किया जाता है, तथापि, वांछित परिणाम RBP और अपने लक्ष्य mRNAs के बीच बातचीत की प्रकृति की वजह से नहीं हासिल हो सकता है.
एक संभावित समस्या कम या भी शाही सेना से कोई संकेत चीर चिप से अलग हो रही है.हालांकि कुल शाही सेना से संकेत हो सकता है, यह अपर्याप्त बाध्यकारी प्रोटीन मोती से नीचे खींच लिया जा रहा है का परिणाम हो सकता है. पहली समस्या निवारण चरण पुष्टि करने के लिए है कि सेलुलर lysate इस्तेमाल किया जा रहा है विशिष्ट RBP की पर्याप्त अभिव्यक्ति है. पुष्टि होने पर, प्रोटीन अंतिम NT2 धोने के बाद अलग किया जा सकता है और Laemmli बफर या किसी अन्य उपयुक्त denaturing बफर में resuspended और 95 पर गरम डिग्री सेल्सियस 5 मिनट के लिए. पश्चिमी धब्बा विश्लेषण इनपुट के रूप में के रूप में अच्छी तरह से lysate नकारात्मक नियंत्रण के साथ समन्वय में इन नमूनों पर इस्तेमाल किया जा सकता है जुड़े प्रोटीन की पर्याप्त नीचे खींच करने के लिए सुनिश्चित करें.
इसके अलावा, क्योंकि सेल lysing इन घटकों का उपयोग करने के लिए आवश्यक है, सामान्य रूप से अलग प्रोटीन और mRNA के बीच असामान्य और अवांछित बातचीत के लिए संभावित पेश किया जा सकता है. इन मुलाकातों संभावित बाँध और "सोख" nonspecific बातचीत के माध्यम से अपने लक्ष्य mRNAs या बंधनकारी प्रोटीन सकता है. इसके अतिरिक्त इन अलग सह में, प्रोटीनकई रूपों में nditions गुना और उनके बंधन रूपांकनों अपने लक्ष्य mRNAs दुर्गम हो जाता है, उनकी बातचीत को रोकने कर सकते हैं. इन दोनों कुशलता से काम कर के रूप में के रूप में अच्छी तरह से इष्टतम इन अवांछित बातचीत को सीमित करने के लिए सूचीबद्ध तापमान के उपयोग के महत्व को मजबूत. इसके अतिरिक्त, प्रत्येक विशिष्ट लक्ष्य प्रोटीन के लिए वाशिंग शर्तों के अनुकूलन के लिए बातचीत की पवित्रता को अधिकतम करने के लिए महत्वपूर्ण होगा. अधिक कड़े धोने की स्थिति की जरूरत हो सकती है. उदाहरण के लिए, धोने बफर एसडीएस या यूरिया अपने संकेत उत्पादन में nonspecific बातचीत और पृष्ठभूमि को कम करने का एक उचित मात्रा के साथ पूरक हो सकता है. यह प्रयोगकर्ता के लक्ष्य के रूप में के रूप में अच्छी तरह से अपने अद्वितीय शारीरिक स्थितियों में लक्ष्य mRNA RBP पर पूरी तरह से निर्भर हो जाएगा. कुछ शर्तों कुछ mRNA विश्लेषण उपकरण है, जो नमूनों की तैयारी में ध्यान दिया जाना चाहिए के लिए उपयुक्त नहीं होगा.
अंत में, हालांकि चीर शाही सेना के संवर्धन में सफल होता हैRBP बातचीत, चीर विधि (चिप) के साथ एक अच्छी तरह से ज्ञात मुद्दा क्षणिक mRNA लक्ष्य पर RBP की विशिष्ट बंधनकारी डोमेन की पहचान करने में असमर्थता है. अद्वितीय अनुक्रम लक्ष्य को अलग करने के लिए चीर द्वारा पीछा किया जाना कई पार से जोड़ने की तकनीक इस्तेमाल किया जा सकता है, लेकिन है, छोटी लहर यूवी के उपयोग न्यूक्लिक एसिड क्षति का कारण बन जाता है. एक नए PAR क्लिप, या photoactivatable ribonucleoside crosslinking और immuoprecipitation, के रूप में जाना जाता विधि लंबी लहर नवजात दोनों स्थिर और क्षणिक आरएनए बातचीत से अद्वितीय बाध्यकारी साइटों की पहचान की अनुमति शाही सेना में thiouridine शामिल यूवी कार्यरत हैं.
कुल मिलाकर, चीर – चिप एक उत्कृष्ट को अलग करने और हमारे समूह के रूप में के रूप में अच्छी तरह से कई अन्य अनुसंधान समूहों द्वारा शाही सेना बंधनकारी प्रोटीन और उनके mRNA लक्ष्य के बीच बातचीत का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया उपकरण के रूप में स्थापित किया गया है. हालांकि प्रकृति और व्यवहार में संवेदनशील, इस प्रक्रिया के समुचित निष्पादन इन RNP परिसरों के अलगाव है, जो हाल ही में जब तक किया गया है, inacc निकलेगाखोज और विश्लेषण के लिए essible.
The authors have nothing to disclose.
रक्षा विभाग (आइडिया पुरस्कार W81XWH-07-0,406) – Ulus Atasoy
Ulus Atasoy NIH RO1 A1080870
Ulus Atasoy NIH R21 A1079341
मिसौरी संस्थागत फंड के विश्वविद्यालय – Ulus Atasoy
Name of Reagent | Company | Catalog Number | Comments |
1 M dithiothreitol | Fisher | BP172-5 | DTT |
DNase 1 | Ambion | 2235 | RNase free |
Ethylendiamine Tetraccetic Acid | Fisher | BP118-500 | EDTA |
Glycogen | Ambion | 9516 | |
1 HEPES | Sigma | H3375-100G | pH 7.0 |
Igepal Nonidet P-40 | USB | 78641 | NP40 |
1 M KCl | Fisher | BP366-500 | |
1 M MgCl2 | Fisher | BP214-500 | |
NT2 Buffer | *See Below | ||
Polysome Lysis Buffer | *See Below | ||
Protease inhibitor cocktail tablets | Roche | 11873580001 | |
Protein A Sepharose Beads | Sigma | P3391 | |
Proteinase K | Fisher | BP1700-100 | |
RNase Out RNase inhibitor | Invitrogen | 10777-019 | 40 U/μl |
1 M NaCl | Fisher | BP358-212 | |
Sodium dodecyl sulfate | Fisher | BP166-500 | SDS |
1 M Tris-HCl | Fisher | BP153-500 | pH 7.4 |
Trizol | Invitrogen | 15596-026 | |
Vanadyl Ribonucleoside Complexes | New England Labs | S1402S | VRC |
Reagent Workup |
Prepare reagents in RNase/DNase-free, DEPC-treated glassware |
Polysome lysis Buffer |
100 mM KCl |
5 mM MgCl2 |
10 mM HEPES (pH 7.0) |
0.5% NP40 |
1 mM DTT |
100 units/ml RNase Out |
400 μM VRC |
Protease inhibitor cocktail tablet |
5 ml of Polysome lysis buffer |
Add 50 μl of 1 M HEPES (pH 7.0) |
500 μl of 1 M KCL |
25 μl of 1 M MgCl2 |
25 μl of NP40 |
4.7 ml RNase-DNase-free H2O |
50 μl of 1 M DTT |
12.5 μl of 100 U/ml RNase Out |
200 μl Protease inhibitor cocktail (dissolved according to manufacturer) |
10 μl 200 mM VRC (at time of use) |
NT2 Buffer |
50 mM Tris-HCl (pH 7.4) |
150 mM NaCl |
1 mM MgCl2 |
0.05% NP40 |
1 L of NT2 Buffer |
50 ml Tris (pH 7.4) |
30 ml 5 M NaCl |
1 ml 1 M MgCl2 |
500 μl NP40 |
820 ml RNase-DNase-free H2O |