En trinnvis protokollen til å isolere og identifisere RNA knyttet komplekser gjennom RIP-Chip.
Som et resultat av utviklingen av high-throughput sekvensering og effektiv microarray analysen har global genekspresjonsanalyse blitt en enkel og lett tilgjengelig form for datainnsamling. I mange forskning og sykdom modeller imidlertid ikke steady state nivåer av målet genet mRNA ikke alltid direkte korrelerer med steady state protein nivåer. Post-transcriptional genregulering er en sannsynlig forklaring på avviket mellom de to. Drevet av bindingen av RNA Binding Proteins (RBP), påvirker etter-transkripsjonell regulering mRNA lokalisering, stabilitet og oversettelse ved å danne en ribonucleoprotein (RNP) kompleks med target mRNAs. Identifisere disse ukjente de novo mRNA mål fra mobilnettet ekstrakter i RNP komplekset er sentral for å forstå mekanismer og funksjoner av RBP og deres resulterende effekt på protein utgang. Denne protokollen skisserer en metode kalt RNP immunoutfelling-microarray (RIP-Chip), som gjør det mulig for identifisering av specific mRNAs forbundet i ribonucleoprotein komplekse, under skiftende eksperimentelle forhold, sammen med alternativer for å ytterligere optimalisere et eksperiment for den enkelte forsker. Med denne viktige eksperimentelt verktøy, kan forskerne undersøke intrikate mekanismer knyttet til post-transcriptional genregulering samt andre ribonucleoprotein interaksjoner.
På grunn av beskaffenheten av dette eksperimentet, optimalisering og erfaring vil være den eneste garantert måter å kunne tilegne de tilsiktede resultater. I mange trinn av denne prosedyren, temperatur og effektiv håndtering av reagenser og produkter er kritisk viktig. Riktig planlegging og gjennomføring av teknikken vil hjelpe sikre at forsøket ble utført på en hensiktsmessig tidsramme på de optimale temperaturer anbefales. Et stort problem med RNA isolering eksperimenter er følsomheten av RNAer for nedbrytning av RNases. Alle reagenser må være RNase fri og lagres eller brukes i RNase-frie beholdere. Dette er et viktig skritt i å sikre integriteten til mRNA prøven. Selv når eksperimentet utføres skikkelig, men, kan det ønskede resultat ikke oppnås på grunn av beskaffenheten av samspillet mellom RBP og dens mål mRNA.
Et potensielt problem er å ha lav eller ingen signal fra RNA isolert ved RIP-Chip.Selv om det kan være et signal fra total RNA, kan dette være et resultat av utilstrekkelig bindingsprotein blir trukket ned av perlene. Det første trinnet i feilsøkingen er å bekrefte at mobilnettet lysate som brukes har tilstrekkelig uttrykk for den spesifikke RBP. Ved bekreftelse, kan protein isoleres etter den siste NT2 vask og resuspendert i Laemmli buffer eller et annet egnet denaturerende buffer og oppvarmet ved 95 ° C i 5 min. Western blot-analyse kan brukes på disse prøvene i samordning med inndata lysat samt negative kontroller for å sikre tilstrekkelig trekk ned av assosiert protein.
Videre, fordi lysering cellen er nødvendig for å få tilgang til disse komponentene, kan den potensielle for unormale og uønskede interaksjoner mellom normalt separerte proteiner og mRNA bli introdusert. Disse interaksjonene kan potensielt binde og "suge opp" målet mRNA eller bindende proteiner gjennom uspesifikke interaksjoner. I tillegg proteiner i disse varierende conditions kan kaste i flere varianter og deres bindende motiver kan bli utilgjengelige for sine mål mRNA, hindrer deres interaksjoner. Begge disse styrke viktigheten av å arbeide effektivt samt utnytte optimale temperaturer oppført å begrense disse uønskede interaksjoner. Tillegg vil optimalisering av vaske driftsforhold for hver bestemte målprotein være kritisk å maksimere renheten av interaksjon. Strengere vaske forhold kan være nødvendig. For eksempel kan vaskebufferen suppleres med SDS eller en passende mengde av urea for å redusere uspesifikke interaksjoner og bakgrunn i signalutgang. Dette vil være helt avhengig av experimenter mål RBP samt målet mRNA i deres unike fysiologiske betingelser. Noen forhold vil ikke være egnet for enkelte mRNA analyseverktøy, som bør nevnes i forberedelse av prøver.
Til slutt, selv om RIP er vellykket i anriking av RNA-RBP interaksjoner, en velkjent problem med RIP (CHIP) metoden er manglende evne til å identifisere de spesifikke bindende domener av RBP på forbigående mRNA mål. Flere tverrbindende teknikkene kan brukes etterfulgt av RIP til isolere unik sekvens mål, men har en tendens til bruk av kortbølget UV til føre til nukleinsyre skade. En ny metode som kalles PAR-CLIP, eller photoactivatable ribonucleoside crosslinking og immuoprecipitation, sysselsetter langbølget UV å innlemme thiouridine inn begynnende RNA slik identifisering av unike bindingssteder fra både stabile og forbigående RNA interaksjoner.
Samlet har RIP-Chip etablert som et utmerket verktøy som brukes til å isolere og studere samspillet mellom RNA proteiner og deres mRNA mål av vår gruppe så vel som mange andre forskningsmiljøer. Selv sensitive i naturen og praksis skal forsvarlig gjennomføring av denne prosedyren gi isolering av disse RNP komplekser, som inntil nylig har vært inaccessible for oppdagelse og analyse.
The authors have nothing to disclose.
Department of Defense (Idea Award W81XWH-07-0406) – For å Ulus Atasoy
NIH RO1 A1080870 – To Ulus Atasoy
NIH R21 A1079341 – To Ulus Atasoy
University of Missouri institusjonelle fond – Til Ulus Atasoy
Name of Reagent | Company | Catalog Number | Comments |
1 M dithiothreitol | Fisher | BP172-5 | DTT |
DNase 1 | Ambion | 2235 | RNase free |
Ethylendiamine Tetraccetic Acid | Fisher | BP118-500 | EDTA |
Glycogen | Ambion | 9516 | |
1 HEPES | Sigma | H3375-100G | pH 7.0 |
Igepal Nonidet P-40 | USB | 78641 | NP40 |
1 M KCl | Fisher | BP366-500 | |
1 M MgCl2 | Fisher | BP214-500 | |
NT2 Buffer | *See Below | ||
Polysome Lysis Buffer | *See Below | ||
Protease inhibitor cocktail tablets | Roche | 11873580001 | |
Protein A Sepharose Beads | Sigma | P3391 | |
Proteinase K | Fisher | BP1700-100 | |
RNase Out RNase inhibitor | Invitrogen | 10777-019 | 40 U/μl |
1 M NaCl | Fisher | BP358-212 | |
Sodium dodecyl sulfate | Fisher | BP166-500 | SDS |
1 M Tris-HCl | Fisher | BP153-500 | pH 7.4 |
Trizol | Invitrogen | 15596-026 | |
Vanadyl Ribonucleoside Complexes | New England Labs | S1402S | VRC |
Reagent Workup |
Prepare reagents in RNase/DNase-free, DEPC-treated glassware |
Polysome lysis Buffer |
100 mM KCl |
5 mM MgCl2 |
10 mM HEPES (pH 7.0) |
0.5% NP40 |
1 mM DTT |
100 units/ml RNase Out |
400 μM VRC |
Protease inhibitor cocktail tablet |
5 ml of Polysome lysis buffer |
Add 50 μl of 1 M HEPES (pH 7.0) |
500 μl of 1 M KCL |
25 μl of 1 M MgCl2 |
25 μl of NP40 |
4.7 ml RNase-DNase-free H2O |
50 μl of 1 M DTT |
12.5 μl of 100 U/ml RNase Out |
200 μl Protease inhibitor cocktail (dissolved according to manufacturer) |
10 μl 200 mM VRC (at time of use) |
NT2 Buffer |
50 mM Tris-HCl (pH 7.4) |
150 mM NaCl |
1 mM MgCl2 |
0.05% NP40 |
1 L of NT2 Buffer |
50 ml Tris (pH 7.4) |
30 ml 5 M NaCl |
1 ml 1 M MgCl2 |
500 μl NP40 |
820 ml RNase-DNase-free H2O |