Die Qualität von embryonalen Maus-Fibroblasten (MEFs) durch die rechte Mausstamm wie CF-1 bestimmt. Pluripotenz-unterstützende MEFs und konditionierte Medien (CM) aus diesen gewonnenen Erkenntnisse sollten den optimalen Konzentrationen von Activin A, Gremlin und TGFß1 für die Activin / Nodal und FGF Signalwege erforderlich, um kooperativ zu halten Selbsterneuerung und Pluripotenz enthalten.
Im allgemeinen menschlichen embryonalen Stammzellen (HES) und humanen induzierten pluripotenten Stammzellen (hiPSCs) 1 kann unter variablen Bedingungen kultiviert werden. Jedoch ist es nicht einfach, ein wirksames System zur Kultivierung dieser Zellen zu etablieren. Da die Kulturbedingungen der Genexpression, die Pluripotenz in hES und hiPSCs verleiht beeinflussen können, ist die Optimierung und Standardisierung der Kultur-Methode von entscheidender Bedeutung.
Die Einrichtung von HES-Linien wurde zuerst unter Verwendung MEFs als Feeder-Zellen und fötalem Rinderserum (FBS) enthaltenden Kulturmedium 2 beschrieben. Als nächstes wurde FBS mit Knockout-Serum-Ersatz (KSR) und FGF2, die Proliferation von hESCs 3 erweitert ersetzt. Schließlich ermöglichen Feeder-freien Kultur-Systemen Kultivierung von Zellen auf Matrigel-beschichteten Platten in KSR-haltige konditionierte Medium (Medium durch MEFs konditioniert) 4. Anschließend haben hESCs Kultur in Richtung Feeder-freien Kultur in chemisch defin bewegted Bedingungen 7.5. Darüber hinaus wurden die möglichen Kontaminierung durch Krankheitserreger und tierische Proteine Kultur Methoden unter Verwendung von xeno-freien Komponenten zu vermeiden, wurden 8 hergestellt.
Um bessere Bedingungen erhalten Maus Feeder-Zellen wurden mit humanen Zelllinien (zB fetale Muskel-und Hautzellen 9, erwachsenen Hautzellen 10, Vorhautfibroblasten 11-12, Fruchtwasser Mesenchymzellen 13) ersetzt worden. Jedoch ist die Effizienz der Wartung undifferenzierten HES mit humaner Vorhaut-Fibroblasten-Feeder-Schichten abgeleiteten nicht so hoch wie die von Maus-Feeder-Zellen aufgrund der niedrigeren Ebene der Sekretion von Activin A 14. Offensichtlich gibt es einen offensichtlichen Unterschied in Wachstumsfaktor durch Maus und menschlichen Feeder-Zellen.
Die Analyse der Transkriptome Maus und Mensch-Feeder-Zellen ergab signifikante Unterschiede zwischen unterstützende und-Stützzellen. Exogene FGF2 ist entscheidend für den UnterhaltNing Selbsterneuerung von hES und hiPSCs, und hat sich als entscheidender Faktor für die Regulation der Expression von TGFß1, Activin A und Gremlin (eine BMP-Antagonist) in Feeder-Zellen identifiziert worden. Activin A wurde gezeigt, dass die Expression von Oct4, Sox2 und NANOG im HES 15-16 induzieren.
Für Langzeit-Kultur, kann HES und hiPSCs auf mitotisch inaktiviert MEFs oder unter Feeder-freien Bedingungen in MEF-CM (MEF-konditioniertem Medium) auf Matrigel-beschichteten Platten gezüchtet werden, um undifferenzierten Zustand aufrecht zu erhalten. Erfolg beider Kulturbedingungen vollständig abhängig von der Qualität der Feeder-Zellen, da sie Auswirkungen auf das Wachstum von HES.
Hier präsentieren wir ein optimiertes Verfahren zur Isolierung und Kultivierung von embryonalen Maus-Fibroblasten (MEFs), Vorbereitung von konditioniertem Medium (CM) und Enzyme Linked Immuno Assay (ELISA) auf das Niveau von Activin A in den Medien zu beurteilen.
Die Isolierung MEFs hier vorgestellte Verfahren ermöglicht die Etablierung eines einheitlichen Kultur Voraussetzung für hESCs und hiPSCs. Darüber hinaus ist die ELISA-System verwendet werden, um Cytokin-Produktion durch Feeder-Zellen zu bewerten, ist ein nützlicher Indikator für die Qualität der MEF-abgeleiteten konditionierten Medien. Die laufende Instandhaltung des Mausstamm (CF1) bietet Unterstützung Fibroblasten ist notwendig, um von Charge zu Charge Variation von Kulturmedien zu vermeiden. Darüber hinaus empfiehlt es sich, mehrere Embryonen aus Mäusen isolieren gleichzeitig eine gleichbleibende Qualität der Zellen zu erhalten. Sicherlich frisch isolierten MEFs kann gefroren bei P0 und P1 werden. Auch inaktiviert MEFs kann in Aliquots eingefroren entsprechender Mengen je nach den Anforderungen für die Zellkultur werden. In der Regel ca. 250.000 Zellen in einer einzigen Vertiefung einer 6-Well-Platte zur Kultur hESCs und iPS-Zellen plattiert werden. Die etabliert und optimiert Verfahren kann routinemäßig verwendet werden, um die Variabilität zu minimieren zwischen unterschiedmieten Experimente.
The authors have nothing to disclose.
Besonderer Dank geht an Dr. Boris Greber für die Einrichtung des Activin A ELISA-Protokoll wie in Greber et al. 2007 veröffentlicht. Wir sind besonders dankbar, dass Frau Monica Shevack für die Vorbereitung der grafischen Übersicht. Wir sind sehr dankbar, dass Dr. Heiko Fuchs für alle Hilfe und wertvolle Anregungen vor und während der Dreharbeiten. Wir möchten alle Mitglieder der Adjaye Labor, vor allem Elisabeth Socha zur Aufrechterhaltung einer konstanten Zufuhr von MEFs und CM danken. Wir erkennen auch unsere Kollegen in der Tierhaltung des MPIMG für ihre ständige Unterstützung. Diese Arbeit wurde teilweise von der Max-Planck-Gesellschaft und der Finanzierung [BMBF, Förderkennzeichen 0315717A], Partner der ERASysBio + Initiative im Rahmen des EU-ERA-NET-Plus im Rahmen des RP7 unterstützt.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
DMEM (High Glucose) | Gibco, Invitrogen | 41966-052 | |
FBS | Biochrom | S0115 | |
L-glutamine | Gibco, Invitrogen | 25030-024 | |
Penicillin-streptomycin | Gibco, Invitrogen | 15140-122 | |
Vacuum filter system | Corning | 431097 | 500 ml, 0.22 μm, PAS |
DMSO | Sigma | D2650 | |
Knockout DMEM | Gibco, Invitrogen | 10829-018 | |
Knockout Serum Replacement | Gibco, Invitrogen | 10828-028 | |
Non-Essential Amino Acids | Gibco, Invitrogen | 11140-035 | |
beta-Mercaptoethanol | Sigma | M7522 | |
PBS | Gibco, Invitrogen | 14190-169 | |
DNase I | Sigma | D4527 | |
Mitomycin C | Roche | 10107409001 | |
Basic Fibroblast Growth Factor | PeproTech | 100-18B | |
Biotinylated Anti-human/mouse/rat Activin A Antibody | R&D Systems | BAM3381 | |
Gelatin | Sigma | G9391 | |
Human/Mouse/Rat Activin A MAb | R&D Systems | MAB3381 | |
0.05% Trypsin-EDTA | Gibco, Invitrogen | 25300-054 | |
Extra Thin Iris Scissors | FST | 14088-10 | |
Extra Fine Graefe Forceps | FST | 11150-10 | |
Pierse Fixation Forceps | FST | 18155-13 |