Detecção MicroRNA em tumores de próstata por Quantitative PCR em tempo real (qPCR)
Summary
Quantitativa em Tempo Real reacção em cadeia da polimerase (qPCR) é um método rápido e sensível para investigar os níveis de expressão de vários microRNA (miRNA) moléculas em amostras de tumor. Usando este método de expressão de centenas de moléculas miRNA diferentes pode ser amplificado, quantificado e analisado a partir do mesmo modelo cDNA.
Abstract
MicroRNAs (miRNAs) são de cadeia simples, 18-24 nucleótidos de comprimento, moléculas de RNA não codificantes. Eles estão envolvidos em praticamente todos os processos celulares, incluindo o desenvolvimento 1, 2 apoptose e regulação do ciclo celular 3. MiRNAs Estima-se que regulam a expressão de 30% a 90% de genes humanos 4 por ligação aos seus RNAs alvo mensageiro (ARNm) 5. Desregulação generalizada de miRNAs tem sido relatada em várias doenças cancerosas e subtipos 6. Devido à sua prevalência e estrutura única, estas moléculas pequenas são susceptíveis de ser a próxima geração de biomarcadores, agentes terapêuticos e / ou alvos.
Os métodos utilizados para investigar a expressão de miRNA incluem SYBR green eu à base de corantes, bem como Taqman-sonda qPCR base. Se miRNAs estão a ser efetivamente utilizado na prática clínica, é imperativo que a sua detecção, frescos e / ou arquivados amostras clínicas ser preciso, reprodutível e specific. qPCR tem sido amplamente utilizado para validar a expressão de miRNAs em análises do genoma inteiro, tais como estudos microarray 7. As amostras utilizadas neste protocolo eram de pacientes que foram submetidos a prostatectomia radical para o cancro da próstata clinicamente localizado, no entanto outros tecidos e linhas celulares pode ser substituído pol espécimes de próstata foram snap-congelado em azoto líquido após a ressecção. As variáveis clínicas e follow-up de informação para cada paciente foram coletadas para análise posterior 8.
Quantificação dos níveis de miRNA em amostras de tumores de próstata. As etapas principais da análise qPCR de tumores são: a extracção de RNA total a síntese de cDNA, e detecção de produtos de qPCR usando miRNA primers específicos. O RNA total, que inclui mRNA, miRNA, e outros pequenos RNAs foram extraídos a partir de amostras utilizando reagente Trizol. Sistema da QIAGEN miScript foi utilizado para sintetizar ADNc e realizar qPCR (Figura 1). MiRNAs endógenos não são polyadenylated, portanto, durante o processo de transcrição reversa, uma polimerase de (A) poli polyadenylates o miRNA. O miRNA é utilizado como um modelo para sintetizar ADNc utilizando oligo-dT e transcriptase reversa. Uma sequência de etiqueta universal sobre a extremidade 5 'de oligo-dT iniciadores facilita a amplificação de cDNA no passo de PCR. A amplificação por PCR do produto é detectado pelo nível de fluorescência emitida pelo SYBR Green, um corante que intercala em DNA de cadeia dupla. Primers específicos miRNA, juntamente com um Primer Universal que se liga à seqüência tag universal irá amplificar sequências específicas de miRNA.
Os ensaios Primer miScript estão disponíveis para mais de mil humano miRNAs específicos e centenas de murino específicos miRNAs. Método de quantificação relativa foi usado aqui para quantificar a expressão de miRNAs. Para corrigir para a variabilidade entre diferentes amostras, níveis de expressão de um miRNA alvo é normalizado para os níveis de expressão de um gene de referência. A escolha de um geem que ne para normalizar a expressão de alvos é crítica na método de quantificação relativa de análise. Exemplos de genes de referência tipicamente usados nesta capacidade são o RNU6B pequenos RNAs, RNU44, e RNU48 como eles são considerados ser estavelmente expressos na maior parte dos exemplos. Neste protocolo, RNU6B é usado como o gene de referência.
Protocol
Discussion
Expressões aberrantes de alguns miRNAs foram consistentemente encontrados em tumores de próstata quando comparado com o tecido normal 10, e alguns destes miRNAs foram nomeados como potenciais novos agentes terapêuticos contra o cancro da próstata 11. Assim, os níveis de expressão aberrante de miRNAs podem ser úteis biomarcadores de diagnóstico e / ou prognóstico. A metodologia qPCR Real-Time aqui apresentado proporciona um ensaio para a quantificação precisa dos níveis de miRNA em tecid…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi financiado pela Canadian Cancer Society Research Institute, conceder nenhuma. 019038.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| TRIzol Reagent | Invitrogen | 15596 |
| miScript Reverse Transcription Kit | Qiagen | 218061 |
| miScript Primer Assays | Qiagen | Experiment specific |
| miScript SYBR Green PCR Kit | Qiagen | 218073 |
| LightCycler 3.5 Real-Time PCR System | Roche | |
| Light Cycler Capillaries | Roche | 04929292001 |
| NanoDrop 1000 spectrophotometer | Thermo Scientific | 2538 |
| Agilent 2100 Bioanalyzer | G2943CA |
Referências
- Reinhart, B. J. MicroRNAs in plants. Genes Dev. 16, 1616-1616 (2002).
- Xu, P. The Drosophila microRNA Mir-14 suppresses cell death and is required for normal fat metabolism. Curr. Biol. 13, 790 (2003).
- Bueno, M. J., Perez, d. e. C. a. s. t. r. o., I, ., Malumbres, M. Control of cell proliferation pathways by microRNAs. Cell Cycle. 7, 3143-3143 (2008).
- Friedman, R. C. Most mammalian mRNAs are conserved targets of microRNAs. Genome Res. 19, 92 (2009).
- Bartel, D. P. MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function. Cell. 116, 281-281 (2004).
- Croce, C. M. Causes and consequences of microRNA dysregulation in cancer. Nat. Rev. Genet. 10, 704 (2009).
- Coppola, V., De, M. R., Bonci, D. MicroRNAs and prostate cancer. Endocr. Relat. Cancer. 17, 1-1 (2010).
- Gordanpour, A. miR-221 Is down-regulated in TMPRSS2:ERG fusion-positive prostate cancer. Anticancer Res. 31, 403-403 (2011).
- Nam, R. K. Expression of the TMPRSS2:ERG fusion gene predicts cancer recurrence after surgery for localised prostate cancer. Br. J. Cancer. 97, 1690 (2007).
- Ambs, S. Genomic profiling of microRNA and messenger RNA reveals deregulated microRNA expression in prostate cancer. Cancer Res. 68, 6162 (2008).
- Liu, C. The microRNA miR-34a inhibits prostate cancer stem cells and metastasis by directly repressing CD44. Nat. Med. 17, 211 (2011).
