MikroRNA Detektion av prostatatumörer genom kvantitativ realtids-PCR (qPCR)
Summary
Kvantitativ realtids-polymeras-kedjereaktion (qPCR) är en snabb och känslig metod för att undersöka expressionsnivåema av olika mikro-RNA (miRNA) molekyler i tumörprover. Med användning av denna metod uttryck av hundratals olika miRNA molekyler kan amplifieras, kvantifieras, och analyserades från samma cDNA-mall.
Abstract
MikroRNA (miRNA) är enkelsträngade, 18-24 nukleotider lång, icke-kodande RNA-molekyler. De är involverade i praktiskt taget varje cellulär process med utveckling 1, apoptos 2 och cellcykelreglering 3. MiRNA beräknas för att reglera uttrycket av 30% till 90% av humana gener 4 genom bindning till sina mål-RNA budbärar (mRNA) 5. Utbredd dysreglering av miRNA har rapporterats i olika sjukdomar och subtyper cancer 6. På grund av deras förekomst och unika struktur, dessa små molekyler är sannolikt att bli nästa generation av biomarkörer, terapeutiska medel och / eller mål.
Metoder som används för att undersöka miRNA uttrycket inkluderar SYBR Green I färgpulverbaserat samt Taqman-prob baserad qPCR. Om miRNA ska användas effektivt i klinisk miljö, är det absolut nödvändigt att deras upptäckt i färsk och / eller arkiveras kliniska prover vara korrekt, reproducerbar, och SPecific. qPCR har använts i stor omfattning för att validera expression av miRNA i hela genom analyser såsom microarray studier 7. De prover som användes i detta protokoll var från patienter som genomgick radikal prostatektomi för kliniskt lokaliserad prostatacancer, men andra vävnader och cellinjer kan vara substituerad i. Prostata prover snabbfrystes i flytande kväve efter resektion. Kliniska variabler och uppföljning information för varje patient togs in för senare analys 8.
Kvantifiering av miRNA nivåer i prostatatumör prover. De viktigaste stegen i qPCR analys av tumörer är: Total RNA-extraktion, cDNA-syntes, och detektion av qPCR produkter med användning av miRNA-specifika primrar. Total-RNA, som innefattar mRNA miRNA, och andra små RNA extraherades från prover med användning av TRIzol-reagens. Qiagen har miScript system användes för att syntetisera cDNA och utföra qPCR (figur 1). Endogena miRNA inte polyadenylated därför under den omvända transkriptionen, polyadenylates en poly (A)-polymeras i miRNA. Den miRNA används som en mall för att syntetisera cDNA med användning av oligo-dT och omvänt transkriptas. En universell tagg-sekvensen på 5'-änden av oligo-dT-primrar underlättar amplifieringen av cDNA i PCR-steget. PCR-produkten amplifiering detekteras genom nivån av fluorescens som emitteras av SYBR Green, ett färgämne som interkalerar till dubbelsträngat DNA. Specifika miRNA primers, tillsammans med en universell primer som binder till den universella taggen sekvensen kommer att förstärka specifika miRNA sekvenser.
De miScript Primer Analyser finns i över tusen mänskligt specifika miRNA och hundratals murina-specifika miRNA. Relativ kvantifiering metod användes här för att kvantifiera uttrycket av miRNA. För att korrigera för variationer mellan olika prover, är expressionsnivåer av en mål-miRNA normaliserades till de expressionsnivåer av en referens-genen. Valet av en GEne som att normalisera uttrycket av mål är kritisk i relativ kvantifiering analysmetod. Exempel på referens gener som vanligtvis används i denna egenskap är den lilla RNA RNU6B, RNU44 och RNU48 eftersom de anses vara stabilt uttryckas i de flesta prover. I detta protokoll är RNU6B används som referens-genen.
Protocol
Discussion
Avvikande uttryck av vissa miRNA har genomgående visat i prostatatumörer jämfört med normal vävnad 10, och några av dessa miRNA har angivits såsom möjliga nya terapeutiska medel mot prostatacancer 11. Därigenom de avvikande expressionsnivåer av miRNA kan vara användbara diagnostiska och / eller prognostisk biomarkörer. Real-Time qPCR metodik presenteras här ger en analys för exakt kvantifiering av miRNA nivåer i prostata tumörvävnad. Den miScript PCR-system användes kan detektera …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete har finansierats av den kanadensiska Cancer Society Research Institute, inte bevilja. 019.038.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| TRIzol Reagent | Invitrogen | 15596 |
| miScript Reverse Transcription Kit | Qiagen | 218061 |
| miScript Primer Assays | Qiagen | Experiment specific |
| miScript SYBR Green PCR Kit | Qiagen | 218073 |
| LightCycler 3.5 Real-Time PCR System | Roche | |
| Light Cycler Capillaries | Roche | 04929292001 |
| NanoDrop 1000 spectrophotometer | Thermo Scientific | 2538 |
| Agilent 2100 Bioanalyzer | G2943CA |
Referências
- Reinhart, B. J. MicroRNAs in plants. Genes Dev. 16, 1616-1616 (2002).
- Xu, P. The Drosophila microRNA Mir-14 suppresses cell death and is required for normal fat metabolism. Curr. Biol. 13, 790 (2003).
- Bueno, M. J., Perez, d. e. C. a. s. t. r. o., I, ., Malumbres, M. Control of cell proliferation pathways by microRNAs. Cell Cycle. 7, 3143-3143 (2008).
- Friedman, R. C. Most mammalian mRNAs are conserved targets of microRNAs. Genome Res. 19, 92 (2009).
- Bartel, D. P. MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function. Cell. 116, 281-281 (2004).
- Croce, C. M. Causes and consequences of microRNA dysregulation in cancer. Nat. Rev. Genet. 10, 704 (2009).
- Coppola, V., De, M. R., Bonci, D. MicroRNAs and prostate cancer. Endocr. Relat. Cancer. 17, 1-1 (2010).
- Gordanpour, A. miR-221 Is down-regulated in TMPRSS2:ERG fusion-positive prostate cancer. Anticancer Res. 31, 403-403 (2011).
- Nam, R. K. Expression of the TMPRSS2:ERG fusion gene predicts cancer recurrence after surgery for localised prostate cancer. Br. J. Cancer. 97, 1690 (2007).
- Ambs, S. Genomic profiling of microRNA and messenger RNA reveals deregulated microRNA expression in prostate cancer. Cancer Res. 68, 6162 (2008).
- Liu, C. The microRNA miR-34a inhibits prostate cancer stem cells and metastasis by directly repressing CD44. Nat. Med. 17, 211 (2011).
