유동세포계측법 및 자동화된 마그네틱 활성화 셀 정렬 (AutoMACS)를 사용 나이브 및 췌장 종양 베어링 마우스에서 골수양 파생 억제 세포 (MDSC)의 작성
Summary
이것은 골수양 유래 억제 세포 (MDSC)를 immunophenotyping 및 GR-1 풍요로운의 신속하고 포괄적인 방법입니다<sup> +</sup마우스 spleens에서> leukocytes. 이 방법은 실용적 GR-1에 대한 풍부 정렬 유동세포계측법 및 AutoMACS 전지를 사용<sup> +</sup용도 MDSC으로 정렬 FACS로 사전> leukocytes<em> 생체내에서</em>과<em> 체외에서</em> assays.
Abstract
MDSC이지나 macrophages, 돌기 세포 및 기생충 감염, 염증, 외상 스트레스, 그라 프트 – 대 – 숙주 질환, 당뇨병 및 암 1-7 포함한 병리 학적 조건에서 림프 장기에 축적 granulocytes의 이기종 인구입니다. 생쥐에서 MDSC 특급 맥-1 (CD11b)과 GR-1 (Ly6G 및 Ly6C) 표면 항원 7. 그것은 MDSC 잘 그들이 크게 확장되는 다양한 종양 베어링 호스트에서 공부하고 있습니다 그리고 7-10 순진 대응에 비해 안티 종양 면역 반응을 억제하는 것이 중요합니다. 그러나 병적인 상태에 따라 억제 11,12의 독특한 메커니즘과 목표가있는 MDSC의 다른 subpopulations가 없습니다. 따라서 가능한 MDSC 인구를 분리하는 효과적인 방법은 시험 관내 및 생체내의 억제 그들의 서로 다른 분자 메커니즘을 elucidating에 중요하다.
최근에는 Ghansah 그룹은 murine 췌장암 모델에서 MDSC의 확장을 보도했다. 우리의 종양 – 베어링 MDSC은 항상성의 손실을 표시하고 순진 MDSC 13에 비해 진압 기능을 향상시켰습니다. MDSC 비율은 순진 대 종양 베어링 생쥐의 림프 구획에 훨씬 적습니다. 이것은 종종 이러한 MDSC의 정확한 비교 분석을 방해 주요 경고입니다. 따라서 사전에 형광 활성 세포 정렬 (FACS)으로 순진 생쥐에서 GR-1 + leukocytes을 풍부하게하는 것은 순결, 생존을 향상하고 크게 정렬 시간을 줄여줍니다. 이들은 정렬 빠른 FACS에 대한 풍부한있다 그러나 종양 베어링 생쥐에서 GR-1 + leukocytes의 농축은 선택 사항입니다. 따라서이 프로토콜에서는, 우리는 MDSC을 immunophenotyping하고 적시에 MDSC 정렬을위한 나이브 생쥐의 spleens에서 GR-1 + leukocytes을 풍요로운의 매우 효율적인 방법을 설명합니다. 면역 적격 C57BL / 6 마우스는 murine Panc02 CE로 주사하고재편은 subcutaneously 순진 마우스 1XPBS을받을 반면. 약 30 일 접종을 게시할 spleens는 세포 분열 체를 사용하여 단일 세포 현탁액으로 수확과 처리됩니다. Splenocytes 그러면 적혈구 (RBC)은 lysed되며 이러한 leukocytes의 나누어지는은 유동세포계측법을 사용 immunophenotype MDSC 비율에 맥-1과 GR-1에 대해 fluorochrome – 복합 항체를 사용하여 묻은 게있다. 병렬 실험에서, 순진 생쥐에서 전체 leukocytes는 자동 마그네틱 활성화 셀 정렬 (autoMACS) 프로 구분 기호를 사용하여 PE-MicroBeads 함께 incubated하고 긍정적으로 선택된 형광등-복합 GR-1 항체, 물들일 수 있습니다. 다음으로, GR-1 + leukocytes의 나누어지는은 유동세포계측법를 사용 MDSC 비율의 증가를 식별하는 맥-1 항체 물들일 수 있습니다. 이제 이러한 Gr1 + 농축 leukocytes는 생체내 및 시험 관내의에서 (순진 대 종양 베어링) 비교 분석에 사용되는 MDSC의 분류 FACS 준비 </em>를 assays.
Protocol
Discussion
이것은 여러 동물 모델에서 다른 림프 조직에 적용 MDSC 인구를 처리하고 immunophentyping에 대한 자세한 방법입니다. 특히 autoMACS 농축은 splenocytes 4 GR-1 고갈, splenocytes과 림프절에서 5 골수양 하위 집합의 정화, CD8의 골수 neutrophils 14 분리와 정제 + 비장에서 T 세포 등 각종 백혈구 인구의 격리에 사용될 수 있습니다 및 림프절 15. 에 관계없이 관심있는 세포 인구…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 USF의 유동세포계측법 핵심 시설을 인정합니다. 우리는 자원을 공유 닥터 드니즈 쿠퍼 감사드립니다. 우리는 또한 설정이 비디오의 촬영에 그들의 도움 마야 코헨, 로라 비롯와 다이애나 Latour 감사드립니다. NN은 박사 원정대 HRD # 0,929,435에 NSF FG-LSAMP 브리지에 의해 지원. 이 작품은 TG에게 수여 미국 암 학회 기관 연구 그랜트 # 93-032-13/Moffitt 암 센터에 의해 재정 지원되었다.
Materials
| REAGENT | COMPANY | CATALOG # | COMMENTS |
| 1X Phosphate Buffered Saline | Thermo Scientific Hyclone | SH30028.02 | Ca2+/Mg2+/Phenol Red-free |
| Albumin from Bovine Serum (BSA) | Sigma-Aldrich | A7906 | Let BSA dissolve undisturbed in PBS; Sterile Environment |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Thermo Scientific Hyclone | SV3001403HI | Heat Inactivated; Sterile Environment |
| Rat anti-mouse CD16/32 monoclonal antibody (Fc Block) | BD Biosciences | 553142 | Sterile Environment |
| Anti-mouse CD11b (Mac-1) FITC | eBiosciences | 11-0112 | Sterile Environment |
| Anti-mouse Ly6G (Gr-1) APC | eBiosciences | 17-5931 | Sterile Environment |
| Anti-mouse Ly6G (Gr-1) PE | eBiosciences | 12-5931 | Sterile Environment |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | Serial Dilution Sterile Environment |
| Cell Dissociation Sieve | Sigma-Aldrich | CD1-1KT | Autoclave before use |
| 70-μm strainer | BD Biosciences | 352350 | Sterile Environment |
| 1X RBC Lysis Buffer | eBiosciences | 00-4333-57 | Warm to room temperature before use; Sterile Environment |
| Petri dishes | Fisher Scientific | 08-757-12 | Sterile Environment |
| 50ml conical tubes | Thermo Scientific | 339652 | Sterile Environment |
| 5ml 12X75mm polystyrene round bottom tubes | BD Biosciences | 352054 | Known as FACS tubes; Sterile Environment |
| 96-well V-bottom plates | Corning | 3897 | Sterile Environment |
| Trypan Blue | Cellgro | 25-900-CI | Sterile Environment |
| PE MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-048-801 | Sterile Environment |
| AutoMACS Pro Separator | Miltenyi Biotec | 130-092-545 | |
| AutoMACS Columns | Miltenyi Biotec | 130-021-101 | |
| AutoMACS Running Buffer | Miltenyi Biotec | 130-091-221 |
Referências
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