AVEXIS הוא קצב העברת נתונים גבוה חלבון אינטראקציה assay פותח מסך באופן שיטתי על הרומן רצפטור ליגנד בזוגות המעורבים בתהליכים תאיים זיהוי סלולריים. היא תוכננה במיוחד כדי לזהות אינטראקציות חלבון חולפות שקשה לזהות באמצעות גישות אחרות קצב העברת נתונים גבוה.
חלבונים תאיים: יחסי הגומלין בין חלבון מופרש או קרום הכבולים חלבונים הם קריטיים עבור הלכידות גם ליזום תקשורת אינטר והבטחת בתוך יצורים תאיים. חלבונים חזה כדי ליצור אינטראקציות תאיים מקודדים על ידי כרבע הגנים האנושיים 1, אבל למרות חשיבותם ושפע, רוב החלבונים האלה תיעדו פרטנר מחייב. בעיקר, וזאת בשל חוסר היכולת להשתלט הביוכימית שלהם: חלבונים בממברנה, משובצים קשה solubilise ב קונפורמציה האם שלהם ומכילים שינויים posttranslational מבנית חשובים. כמו כן, זיקות את האינטראקציה בין חלבונים הקולטן מאופיינים לעיתים קרובות על ידי כוחות אינטראקציה נמוכות מאוד (מחצית חיים <1 2) precluding זיהוי שלהם נפוץ בשימוש שיטות רבות קצב העברת נתונים גבוה 2.
כאן אנו מתארים assay, AVEXIS (שוקקות מבוסס EXtracelluLAR אינטראקציה מסך) אשר מתגבר על אתגרים אלה טכניים המאפשרים זיהוי של אינטראקציות חלבון חלשים מאוד (t 1/2 ≤ 0.1 שניות) עם שיעור נמוך חיובי כוזב 3. Assay מיושם בדרך כלל בפורמט תפוקה גבוהה, כדי לאפשר את הקרנת שיטתית של אלפים רבים של אינטראקציות בפורמט נוח microtitre צלחת (איור 1). היא מסתמכת על ייצור של חלבון רקומביננטי מסיסים ספריות המכילות את שברי ectodomain של קולטנים בתא השטח או חלבונים המופרשים שבו למסך עבור אינטראקציות, לכן, גישה זו מתאימה עבור סוג I, Type II, ה-GPI צמודות קולטנים בתא השטח ומופרשת חלבונים אבל לא קרום חלבונים multipass כגון תעלות יונים או מובילי.
הספריות חלבון רקומביננטי מופקים באמצעות מערכת נוחה ברמה גבוהה ביטוי יונקים 4, על מנת להבטיח כי שינויים posttranslational חשובים כגון glycosylaאג"ח tion ו disulphide נוספים. חלבונים רקומביננטיים לידי ביטוי מופרשים לתוך המדיום והפיק בשתי צורות: הפיתיון biotinylated שניתן שנתפסו על השלב streptavidin מצופה מוצק מתאים להקרנה, וגם אנזימים מתויג pentamerised (β-lactamase) טרף. הפיתיון וחלבונים טרף מוצגים זה לזה בצורה בינארית כדי לזהות אינטראקציות ישירות ביניהם, בדומה ELISA המקובלת (איור 1). Pentamerisation של החלבונים טרף מושגת באמצעות רצף הפפטיד בחלבון מן oligomeric מטריקס הסחוס (COMP), ומגביר את הריכוז המקומי של ectodomains ובכך לספק רווחים שוקקות משמעותיים כדי לאפשר אינטראקציות אפילו חולפות מאוד כדי להתגלות. על ידי נרמול הפעילות של פיתיון וגם טרף לרמות שנקבעו מראש לפני ההקרנה, הראינו כי האינטראקציות שיש monomeric חצאי חייהם של 0.1 שניות ניתן לאתר עם מחירים נמוכים חיוביות כוזבות 3.
כאשר תאים חיים הם נצפו in vivo, קרום הפלזמה שלהם להפגין התנהגות דינמית מאוד: הארכת ואת קרום תהליכים חוזרת בה כפי שהם ליצור קשר ולתקשר עם 2 שכניהם. אינטראקציות פיזיות בין הממברנה משובצים חלבונים קולטנים אשר מתווכים רבים של קשרים אלה התפתחו להיות חלש מאוד, כדי לאפשר התנהגות זו ניעתי מאוד. ההערכה היא כי החוזק אינטראקציה monomeric חלש כמו 50 מיקרומטר יכול להיות מספיק כדי לנהוג אינטראקציות ספונטניות על צפיפות קולטני פיזיולוגיים 9 שהופך גילוי אינטראקציות חדשות מאוד מאתגר 2,10. השיטה המתוארת כאן AVEXIS מספק שיטה רגישה לגילוי חלבון תאי חולף: אינטראקציות חלבון זה יכול להיות מיושם באופן מדרגי עם שיעור נמוך חיובי כוזב. בעוד שיטות אחרות להרחבה פותחו לזיהוי אינטראקציות תאיים 11-15,אחד היתרונות של AVEXIS היא כי פרמטרים ניסיוניים כמו פיתיון ופעילויות טרף היה לכמת לזהות אפילו החלש ביותר של אינטראקציות (t 1/2 ≤ 0.1 ים) תוך שמירה על שיעור נמוך חיובי כוזב 3. בנוסף, הכנת נהלי יעיל וחזק מדגם אפשרו זה assay להיות מיושם בקנה מידה הרבה יותר גדול מאשר מבחני אחרים שתיארנו לאחרונה המסך אינטראקציה שיטתית בהיקף של מעל 16,500 ~~~HEAD=NNS אינטראקציות אפשריות 16.
Assay יכול להתבצע על חלבון כלשהו אשר ניתן לבטא שבר מסיסים חלבון רקומביננטי. ולכן זה כולל חלבונים המכילים פפטיד N-מסוף האות כגון סוג I, ה-GPI צמודות ומופרשת חלבונים. עיצבנו לאחרונה חבילה של וקטורים כי עכשיו יאפשרו לנו להביע את סוג החלבונים השנייה כמו פיתיונות 17. Assay אינו מתאים בדרך כלל קרום חלבונים multipass כגון טרנספורטר יוןS או משאבות מאז לא סביר שהם להיות מקופל בצורה נכונה מחוץ להקשר של קרום הפלזמה. יש לנו ליישם את זה על מגוון רחב של מערכות שונות הביעו בהצלחה חלבונים תאיים מ 3,16,18 דג הזברה, אדם, עכבר ו פ falciparum עבור מסכי אינטראקציה.
מבחינת המשאבים הדרושים כדי להקים מסך AVEXIS, מצאנו כי צוואר בקבוק משמעותי, בחירת בנייה, ריצוף מלא של פלסמידים ביטוי. היבט זה של השיטה יכול לקחת עד שנה כדי להפוך ~ 100 הפיתיון בונה טרף, אך עם עלות ירידה של סינתזה הגן, עכשיו אנחנו מעדיפים מסחרית מיקור חוץ היבט זה של הפרויקט. מערכת ביטוי יונקים יחד עם גדול רועד תרבות רקמות חממה (אנו משתמשים Cell HT INFORS Multitron) מאפשרת לחוקר יחיד לבטא לנרמל את הפיתיון עד 100 ~ וחלבונים טרף בחודש. לאחר החלבונים מיוצרים מנורמל, Screening עבור אינטראקציות מהירה של עד 12 לוחות 96-גם בטיפול בנוחות ליום. ציוד העידו רק שפיתחנו כדי להקל על ייצור של מספר כה גדול של חלבונים הוא בוכנה אוויר מונחה דחוס המשמש להעביר עד חמישה supernatants דרך פילטר 0.22μm במקביל.
המעמד המרכזי של אינטראקציות שעלול לפספס בהשוואה האינטראקציות הצפויות מן הספרות (נגטיבים שווא) הם אינטראקציות homophilic, אם כי חלקם של אינטראקציות אלה ניתן לאתר 3. במקרים שבהם האינטראקציות הצפויות לא מזוהים, אנו מאמינים כי הדבר נובע היווצרות של אינטראקציות homophilic על ידי החלבונים טרף (טרף "מיסוך" אפקט) אשר לאחר מכן מונע אינטראקציות עם חלבונים נוספים הפיתיון חסרי יכולת תנועה. התדירות שבה אינטראקציות מזוהים תלוי תוכן של ספריית חלבון שהוקרנו. כמדריך לקורא, מסך של> 30, 000 אינטראקציות בתוך superfamily אימונוגלובולינים דג הזברה הביא 188 חיוביות – תדר של 0.6% 3,16,18. בדיקה מהירה מאוד, כי ניתן לבצע כדי לאמת את כל הלהיטים חיוביות הוא להחליט אם את האינטראקציה ניתן להבחין בשתי מגמות הפיתיון, טרף, כלומר, יכול האינטראקציה אותה להתגלות בלי קשר כמו גם הפיתיון של האם חלבונים מחייב נוכחים או טרף. בכל פעם אנו רואים התנהגות זו הדדיות, מחייב לאחר מכן כבר הוכח להיות ספציפי על ידי הוכחת מחייב saturable ישירה של חלבונים מטוהרים באמצעות משטח plasmon תהודה. יש להדגיש כי אנו מגבירים את הלהיטות מחייב באופן מלאכותי על ידי pentamerising החלבונים טרף, אנחנו לא רואים את assay מתאים כמותית השוואת עוצמות אינטראקציה. כדי לקבל פרמטרים מחייבים biophysical של אינטראקציות בהם אנו משתמשים חלבונים monomeric ותהודה plasmon פני השטח. לבסוף, לאחר אינטראקציה זוהה, הייהטבע התפוקה של GH assay עושה את זה קל יחסית להתאים את assay למסך ריאגנטים כמו נוגדנים או מולקולות קטנות לחסום את האינטראקציה.
The authors have nothing to disclose.
עבודה זו נתמכה על ידי מספר Wellcome Trust מענק [077108] הוענק GJW.
Name of reagent | Company | Cat. Number | Comments |
Freestyle media | Invitrogen | 12338018 | |
Nitrocefin | Calbiochem | 484400 | |
SA-coated microtitre plates | Nunc | 734-1284 | |
OX68 antibody | AbDSerotec | MCA1022R | |
Dialysis tubing | Pierce | PN68100 | |
Polymyxin B | Sigma | P4932 | |
D-biotin | Sigma | B4639-5G | |
Substrate-104 | Sigma | 1040-506 | |
Vivaspin-20 centrifugal concentrators | Sartorius | VS2002 | |
0.22 μm filters | Nalgene | 190-2520 |