AVEXIS एक उच्च throughput प्रोटीन बातचीत के उपन्यास कोशिकी रिसेप्टर ligand सेलुलर मान्यता प्रक्रिया में शामिल जोड़े के लिए व्यवस्थित स्क्रीन करने के लिए विकसित परख है. यह विशेष रूप से है कि अन्य उच्च throughput दृष्टिकोण का उपयोग कर की पहचान करने के लिए मुश्किल हैं क्षणिक प्रोटीन बातचीत का पता लगाने के लिए डिज़ाइन किया गया है.
Extracellular protein:protein interactions between secreted or membrane-tethered proteins are critical for both initiating intercellular communication and ensuring cohesion within multicellular organisms. Proteins predicted to form extracellular interactions are encoded by approximately a quarter of human genes1, but despite their importance and abundance, the majority of these proteins have no documented binding partner. Primarily, this is due to their biochemical intractability: membrane-embedded proteins are difficult to solubilise in their native conformation and contain structurally-important posttranslational modifications. Also, the interaction affinities between receptor proteins are often characterised by extremely low interaction strengths (half-lives < 1 second) precluding their detection with many commonly-used high throughput methods2.
Here, we describe an assay, AVEXIS (AVidity-based EXtracellular Interaction Screen) that overcomes these technical challenges enabling the detection of very weak protein interactions (t1/2 ≤ 0.1 sec) with a low false positive rate3. The assay is usually implemented in a high throughput format to enable the systematic screening of many thousands of interactions in a convenient microtitre plate format (Fig. 1). It relies on the production of soluble recombinant protein libraries that contain the ectodomain fragments of cell surface receptors or secreted proteins within which to screen for interactions; therefore, this approach is suitable for type I, type II, GPI-linked cell surface receptors and secreted proteins but not for multipass membrane proteins such as ion channels or transporters.
The recombinant protein libraries are produced using a convenient and high-level mammalian expression system4, to ensure that important posttranslational modifications such as glycosylation and disulphide bonds are added. Expressed recombinant proteins are secreted into the medium and produced in two forms: a biotinylated bait which can be captured on a streptavidin-coated solid phase suitable for screening, and a pentamerised enzyme-tagged (β-lactamase) prey. The bait and prey proteins are presented to each other in a binary fashion to detect direct interactions between them, similar to a conventional ELISA (Fig. 1). The pentamerisation of the proteins in the prey is achieved through a peptide sequence from the cartilage oligomeric matrix protein (COMP) and increases the local concentration of the ectodomains thereby providing significant avidity gains to enable even very transient interactions to be detected. By normalising the activities of both the bait and prey to predetermined levels prior to screening, we have shown that interactions having monomeric half-lives of 0.1 sec can be detected with low false positive rates3.
जब जीवित कोशिकाओं vivo में मनाया जाता है, उनकी प्लाज्मा झिल्ली अत्यधिक गतिशील व्यवहार एक्ज़िबिट: विस्तार और retracting झिल्ली प्रक्रियाओं के रूप में वे संपर्क और अपने पड़ोसियों के 2 के साथ संवाद. झिल्ली एम्बेडेड रिसेप्टर प्रोटीन के बीच शारीरिक बातचीत जो इन संपर्कों के कई मध्यस्थता के अत्यंत इतना कमजोर के रूप में यह अत्यधिक गतिशील व्यवहार करने की अनुमति विकसित किया है. यह अनुमान लगाया गया है कि 50 माइक्रोन के रूप में कमजोर के रूप में monomeric बातचीत ताकत शारीरिक रिसेप्टर 9 घनत्व जो उपन्यास अत्यंत से 2,10 चुनौतीपूर्ण बातचीत का पता लगाने के बनाता है पर सहज बातचीत को ड्राइव करने के लिए पर्याप्त हो सकता है. बातचीत प्रोटीन है कि एक कम झूठी सकारात्मक दर के साथ एक स्केलेबल ढंग से लागू किया जा सकता है: AVEXIS विधि यहाँ वर्णित के क्षणिक कोशिकी प्रोटीन का पता लगाने के लिए एक संवेदनशील तरीका प्रदान करता है. जबकि अन्य स्केलेबल तरीकों कोशिकी बातचीत 11-15 का पता लगाने के लिए विकसित किया गया है,AVEXIS का एक लाभ यह है कि चारा और शिकार की गतिविधियों के रूप में प्रयोगात्मक मापदंडों के लिए भी बातचीत की सबसे कमजोर (टी 1/2 ≤ 0.1 है) का पता लगाने, जबकि एक कम झूठी सकारात्मक 3 दर को बनाए रखना मात्रा निर्धारित किया गया है. इसके अलावा, सुव्यवस्थित और मजबूत नमूना तैयार करने की प्रक्रिया इस परख सक्षम है अन्य assays की तुलना में एक बहुत बड़े पैमाने पर लागू किया जाना है और हम हाल ही में एक व्यवस्थित बातचीत ~ 16,500 संभावित 16 बातचीत में कुल स्क्रीन का वर्णन किया है.
परख के लिए यह एक घुलनशील पुनः संयोजक प्रोटीन टुकड़ा व्यक्त करने के लिए संभव है किसी भी प्रोटीन पर किया जा सकता है. यह इसलिए कि एक एन टर्मिनल के रूप में मैं, प्रोटीन जीपीआई से जुड़े और स्रावित प्रकार संकेत पेप्टाइड शामिल प्रोटीन भी शामिल है. हमने हाल ही में वैक्टर का एक सूट है कि अब हमें फँसाना चाहे के रूप में 17 प्रकार द्वितीय प्रोटीन व्यक्त करने के लिए सक्षम बनाया है. परख आम तौर पर multipass ऐसे आयन ट्रांसपोर्टर के रूप में झिल्ली प्रोटीन के लिए उपयुक्त नहीं हैया पंपों के बाद से वे सही ढंग से एक प्लाज्मा झिल्ली के संदर्भ के बाहर तह किया जा उम्मीद नहीं कर रहे हैं. हम विभिन्न प्रणालियों की एक किस्म के लिए आवेदन किया है और सफलतापूर्वक व्यक्त zebrafish 3,16,18, मानव, माउस और पी. प्रोटीन से कोशिकी बातचीत स्क्रीन के लिए फाल्सीपेरम.
एक AVEXIS स्क्रीन स्थापित करने के लिए आवश्यक संसाधनों के मामले में, हमने पाया है कि एक महत्वपूर्ण टोंटी चयन, निर्माण, और अभिव्यक्ति plasmids के अनुक्रमण पूर्ण है. विधि का यह पहलू एक साल के लिए लेने के लिए ~ 100 चारा और शिकार constructs कर सकते हैं, तथापि, जीन संश्लेषण की कम लागत के साथ, हम अब वाणिज्यिक पक्ष परियोजना के इस पहलू के आउटसोर्सिंग. एक बड़े मिलाते हुए टिशू कल्चर इनक्यूबेटर (हम एक INFORS एचटी Multitron सेल का उपयोग करें) के साथ स्तनधारी अभिव्यक्ति एक साथ प्रणाली एक एकल व्यक्त करने के लिए और 100 ~ चारा और शिकार प्रोटीन एक महीने के लिए मानक के अनुसार अनुसंधानकर्ता सक्षम बनाता है. एक बार प्रोटीन का उत्पादन कर रहे हैं और सामान्य, एसबातचीत के लिए creening बारह 96 अच्छी तरह से किया जा रहा है आसानी से प्रति दिन संसाधित प्लेट के साथ तेजी से है. केवल bespoke उपकरण है कि हम करने के लिए प्रोटीन की इतनी बड़ी संख्या के उत्पादन की सुविधा के लिए विकसित किया है एक संपीड़ित हवा चालित पिस्टन जो पांच supernatants समानांतर में एक 0.22μm फिल्टर के माध्यम से पारित करने के लिए प्रयोग किया जाता है.
जब साहित्य (झूठी नकारात्मक) से उम्मीद बातचीत की तुलना में याद किया जा सकता है कि बातचीत का मुख्य वर्ग homophilic बातचीत कर रहे हैं, हालांकि इन संबंधों के कुछ 3 से पता लगाया जा सकता है. मामलों में जहां बातचीत की उम्मीद नहीं कर रहे हैं पता है, हम मानते हैं कि इस शिकार प्रोटीन (एक शिकार "मास्किंग" प्रभाव) के द्वारा homophilic बातचीत जो तो स्थिर चारा प्रोटीन के साथ आगे बातचीत रोकता के गठन के कारण है. आवृत्ति, जिस पर बातचीत कर रहे हैं पता जांच पुस्तकालय जा रहा है प्रोटीन की सामग्री पर निर्भर करता है. पाठक के लिए एक गाइड,> 30 की स्क्रीन के रूप मेंहै, zebrafish इम्मुनोग्लोबुलिन superfamily भीतर 000 बातचीत 188 सकारात्मक में हुई 0.6 3,16,18% की एक आवृत्ति. एक बहुत तेजी से जाँच लें कि किसी भी सकारात्मक हिट की पुष्टि के लिए किया जा सकता है निर्धारित करने के लिए कि क्या बातचीत दोनों चारा शिकार झुकाव में पता लगाया जा सकता है, कि, एक ही बातचीत किया जा सकता है कि क्या बंधनकारी प्रोटीन मौजूद हैं चाहे या तो एक प्रलोभन के रूप में पता लगाया या एक शिकार है. जब भी हम इस अदल – बदल करना व्यवहार मनाया, बाध्यकारी बाद में सतह plasmon अनुनाद का उपयोग शुट्ठ प्रोटीन की प्रत्यक्ष saturable बाध्यकारी प्रदर्शन विशिष्ट होना दिखाया गया है. बात पर जोर दिया कि क्योंकि हम कृत्रिम शिकार प्रोटीन pentamerising के बंधन उत्सुकता बढ़ाने हम मात्रात्मक बातचीत की ताकत की तुलना के लिए उपयुक्त परख पर विचार नहीं करते. बातचीत हम monomeric प्रोटीन और सतह plasmon अनुनाद उपयोग की biophysical बाध्यकारी पैरामीटर प्राप्त करने के लिए. अंत में, एक बार एक बातचीत की पहचान की गई है, हायपरख की gh throughput के स्वभाव यह अपेक्षाकृत आसान परख एंटीबॉडी या छोटे अणुओं है कि बातचीत के ब्लॉक के रूप में अभिकर्मकों के लिए स्क्रीन के लिए अनुकूल बनाता है.
The authors have nothing to disclose.
इस काम के वेलकम ट्रस्ट अनुदान [077,108] संख्या के द्वारा समर्थित किया गया GJW के लिए सम्मानित किया गया.
Name of reagent | Company | Cat. Number | Comments |
Freestyle media | Invitrogen | 12338018 | |
Nitrocefin | Calbiochem | 484400 | |
SA-coated microtitre plates | Nunc | 734-1284 | |
OX68 antibody | AbDSerotec | MCA1022R | |
Dialysis tubing | Pierce | PN68100 | |
Polymyxin B | Sigma | P4932 | |
D-biotin | Sigma | B4639-5G | |
Substrate-104 | Sigma | 1040-506 | |
Vivaspin-20 centrifugal concentrators | Sartorius | VS2002 | |
0.22 μm filters | Nalgene | 190-2520 |