in vitroで中皮クリアランスアッセイでそのモデルの卵巣がんの転移の初期段階を
Summary
ここで説明した中皮クリアランスアッセイは、蛍光標識細胞とタイムラプスビデオ顕微鏡可視化と定量的に卵巣癌多細胞スフェロイドと中皮細胞単層の相互作用を測定するために利用しています。このアッセイは、卵巣癌転移の初期段階をモデル化します。
Abstract
卵巣癌は、米国1の癌関連死の第五主要な原因である。治療への積極的な初期応答にもかかわらず、卵巣癌の女性の70〜90％が新たな転移を開発し、再発はしばしば2致命的である。それは、中間と後期段階の卵巣癌のためのより良い治療法を開発するために、二次転移が起こるかを理解するため、必要がある。悪性細胞が原発腫瘍部位から切り離し、腹腔内全体に普及させるときに卵巣がんの転移が発生します。播種細胞が腹腔3（図1、動画1）内の臓器に多クラスタ、または回転楕円体のいずれかのまま添付されていないか、またはインプラントを形成することができる。
腹腔内臓器のすべてが中皮細胞4-6（図2）のシングル、連続、層が並んでいます。しかし、中皮細胞は下から不在であるとして摘出したヒト腫瘍組織切片3,5-7（図2）の電子顕微鏡の研究によって明らかにされた腹膜腫瘍塊。これは中皮細胞が未知のプロセスによって、腫瘍塊の下から除外されていることを示唆している。
in vitro実験前の8中皮細胞に対するよりも原発性卵巣癌細胞は細胞外マトリックスへのより効率的に取り付けることが示され、さらに最近の研究では、原発性腹膜中皮細胞が実際に接着および浸潤に比べて卵巣癌細胞の接着および浸潤（に障壁を提供示した中皮細胞で覆われていない基板）9,10ます。これは中皮細胞は、卵巣癌の転移に対する障壁として作用することを示唆している。卵巣癌細胞は、この障壁を突破し、持っている皮を除外したことにより細胞および分子メカニズムは、最近まで不明であった。
ここでは、目を記述するin vitroアッセイのためのeの方法論をモデル生体内 （図3、映画2） の卵巣癌細胞のスフェロイドと中皮細胞との相互作用。我々のプロトコルは、中皮単層8月16日卵巣腫瘍細胞の相互作用を解析するための前述の方法から適応され、最初に卵巣腫瘍細胞はの排除を促進するためのミオシンとトラクション力のインテグリン依存性活性化を利用して表示するレポートに記載された腫瘍回転楕円体17の下から中皮細胞。このモデルは、相互作用の空間的および時間的な情報を提供し、リアルタイムで2つの細胞集団を監視するタイムラプス蛍光顕微鏡を利用しています。中皮細胞が緑色蛍光タンパク質（GFP）を発現しながら卵巣癌細胞は、赤色蛍光タンパク質（RFP）を発現する。 RFP発現卵巣癌細胞のスフェロイドは、GFPを発現する中皮単層に接続します。スフェロイドの広がり、侵入し、脇に単分子層に穴を作成中皮細胞を強制します。この穴は、GFPイメージの負の領域（黒）として可視化される。穴の面積は、次に定量的に制御および卵巣癌および/または中皮細胞の実験的集団の間のクリアランス活性の違いを分析するために測定することができます。このアッセイは、卵巣癌細胞（条件ごとに回転楕円体X 20から30回転楕円体当たり100細胞）のごく少数を必要とするので、貴重な原発腫瘍の細胞サンプルを使用して、このアッセイを行うことが可能である。さらに、このアッセイは、簡単にハイスループットスクリーニングに適応することができます。
Protocol
Discussion
ここで紹介する "中皮クリアランスAssayは、"偉大な空間的·時間的に詳細に、卵巣癌多細胞スフェロイドと中皮細胞単層の相互作用を監視するためのタイムラプス顕微鏡を使用しています。以前は、いくつかのグループ8-14卵巣癌細胞にアタッチし、中皮細胞単層に侵入することを示すためにエンドポイントアッセイを使用していた。このアッセイは、これら2つの細胞集団のダ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
私たちは、ハーバード大学医学部ニコンイメージングセンターは、特にジェニファー·ウォーターズ、ララペトラークとウェンディサーモン、訓練のため、それらのタイムラプス顕微鏡の使用を感謝したいと思います。また、貴重な議論のためにローザNgとアヒム·Besserに感謝します。この作品は、NIHグラント5695837（M. Iwanickiまで）とJSBにGM064346によってサポートされていました、博士ミリアムとシェルドンG.アデルソン医学研究財団（JSBまで）からの助成金によって。
Materials
| Reagent | Company | Catalog Number | Comments |
| OVCA433 Ovarian Cancer Cells | Gift from Dr. Dennis Slamon | ||
| ZT Mesothelial Cells | Gift from Dr. Tan Ince | ||
| Medium 199 | Gibco | 19950 | |
| MCDB105 | Cell Applications Inc. | 117-500 | |
| FBS-heat inactivated | Gibco | 10082 | |
| Pen-Strep | Gibco | 15070 | |
| 96 well plates | Corning Costar | 3799 | |
| Polyhydroxyethylmethacrylate (poly-HEMA) | Sigma Aldrich | 192066-25G | For poly-HEMA solution dissolve 6mg poly-HEMA powder in 1ml of 95% EtOH |
| EtOH | Pharmco-aaper | 111ACS200 | Dilute to 95% in dH20 |
| Cell culture hood | Nuaire | NU-425-300 | |
| Tissue culture incubator | Thermo Scientific | 3110 | |
| incubator for poly-HEMA plates | Labline Instruments | Imperial III 305 | |
| Tabletop centrifuge | Heraeus | 75003429/01 | |
| 6 well glass-bottom dish | MatTek corp. | P06G-1.5-20-F | |
| Fibronectin | Sigma | F1141-1MG | |
| PBS | Cellgro | 21-040-CV | |
| Timelapse Microscope: | |||
| Microscope | Nikon | Ti-E Inverted Motorized Fluorescence time-lapse microscope with integrated Perfect Focus System | |
| Lens | Nikon | 20X-0.75 numerical apeture | |
| Halogen transilluminator | Nikon | 0.52 NA long working distance condenser | |
| Excitation and emission filters | Chroma single pass filters in Nikon housing | GFP Ex 480/40, Em 525/50 RFP-mCherry Ex 575/50 Em 640/50 | |
| Transmitted and Epifluoresce light path | Sutter | Smart Shutters | |
| Linear-encoded motorized stage | Nikon | ||
| Cooled charged-coupled device camera | Hamamatsu | ORCA-AG | |
| Microscope incubation chamber with temperature and CO2 control | custom-built | ||
| Vibration isolation table | TMC | ||
| NIS-Elements software | Nikon | Version 3 |
Referências
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